拟南芥ERF5介导的植物镉耐受的分子机制研究

Our previous studies showed that loss of function of transcription factor ERF5 led to enhanced cadmium (Cd) stress tolerance in Arabidopsis, and that the erf5-1 mutant had significantly higher Cd content compared with the wild type. Using the transient expression system in Nicotiana benthamiana and qRT-PCR, we found that GSH1, a key gene inolved in glutathione-dependent phytochelatin synthesis pathway, may be a target of ERF5, suggesting that ERF5 negatively regulates Cd accumulation and tolerance by inhibiting GSH1 transcription. In addition, we also found that ERF5 interacted with mitogen-activated protein kinases MAPK3/6, and that the mpk3-1 and mpk6-1 mutants were sensitive to Cd stress. We accordingly speculated that, in response to Cd stress, the mitogen-activated protein kinases MAPK3/6 were activated and phosphorylated ERF5, which induced to attenuate the transcriptional activity of ERF5, and thereby increasing the transcription of GSH1 to regulate Cd accumulation and tolerance of plants. In this project, we propose to study the above-mentioned work hypothesis to clarify a nolve MAPK3/6-ERF5-GSH1 signaling pathway, which will provide not only new insights into understanding the mechanisms of heavy metal detoxification in plants but also the novel genes for engineering effeicient plants for phytoremediation of heavy metal-contamined soils.

前期研究发现，转录因子ERF5功能缺失导致拟南芥对镉（Cd）胁迫的耐受增强，且erf5-1突变体中Cd含量显著升高。进一步利用烟草瞬时表达系统和qRT-PCR技术初步确定GSH1基因（谷胱甘肽依赖的植物螯合肽合成途径上关键基因）可能是ERF5的一个靶基因，暗示ERF5可能通过负调节GSH1转录来调控植物对Cd的积累与耐受；此外，还发现ERF5和MAPK3/6存在互作，且mpk3-1和mpk6-1突变体对Cd胁迫敏感。据此推测：在响应Cd胁迫过程中MAPK3/6被激活，并对ERF5进行磷酸化，从而解除其转录抑制活性，进而增加GSH1的转录来调节植物对Cd的积累和耐受。本项目拟围绕上述假说开展相关研究，阐明一条植物响应Cd胁迫的新的信号通路：MAPK3/6-ERF5-GSH1。该研究不仅有助于揭示新的植物重金属解毒的分子机理，而且为利用植物修复基因工程技术治理土壤重金属污染提供新的基因资源。

镉（Cd）是一种具有植物毒性的重金属，易于被植物根系吸收并运输到地上部分，在各器官中积累，从而抑制植物的正常生长发育，甚至死亡。乙烯响应因子ERF5能够通过调控基因的表达参与多种生物和非生物胁迫反应，但是其在植物响应Cd胁迫中的作用尚不清楚。在研究中，我们发现转录因子ERF5功能缺失导致拟南芥对Cd胁迫的耐受增强，而过表达植株对Cd胁迫敏感。Cd含量检测结果显示与野生型相比，erf5-1突变体中Cd含量显著升高，而过表达植株中含量降低。BSO表型实验以及GSH和PCs含量检测结果显示BSO处理导致erf5-1突变体的Cd耐受表型消失，Cd处理后突变体中的GSH和PCs含量比野生型中多而过表达植株中含量较少，且突变体中GSH依赖的PCs合成途径相关基因的转录水平显著增加，过表达植株中表达量降低，这些结果表明ERF5基因可能通过GSH依赖的PCs合成途径调控植物Cd耐受。烟草瞬时表达系统分析和染色质免疫共沉淀的结果表明转录因子ERF5直接结合到GSH1、GSH2和PCS2 基因启动子上，从而抑制这些基因的表达。酵母双杂交实验和Pull-down实验证实ERF5与MAPK3/6之间存在互作关系，并且mpk3-1突变体和双突变体mpk3SR植株对Cd胁迫敏感，过表达MAPK3/6基因使植株对Cd胁迫耐受。生物信息分析显示ERF5上存在潜在的磷酸化位点，遗传学分析结果也说明转录因子ERF5被磷酸化后导致植株对Cd胁迫敏感。同时，烟草瞬时表达系统分析结果表明磷酸化ERF5使得GSH1蛋白表达水平下降，而去磷酸化ERF5则使得GSH1蛋白表达被激活，MAPK3介导的ERF5的磷酸化解除了其对GSH1的转录抑制。综上所述，我们推测在正常生理条件下，ERF5不被MAPK3磷酸化，从而抑制GSH1的转录；而在植物受到Cd胁迫时，ERF5被MAPK3磷酸化后，对GSH1转录水平的抑制作用解除，GSH1的表达被激活，从而激活GSH介导的Cd解毒途径，增加Cd积累和耐受。目前为止，已发表高水平论文3篇，申请国家发明专利1项，培养研究生8人，后续数据进一步完善和验证后有望发表高水平论文1-2篇。

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