病原真菌诱导的东亚飞蝗特异表达基因研究

真菌是引起昆虫疾病的重要病原微生物，在害虫防治中具有重要应用潜力，理解真菌诱导的昆虫防御分子机制研究，可为害虫防治提供新的依据和潜在靶标。由于昆虫防御病原真菌的研究较少，本项目以东亚飞蝗和绿僵菌为模式体系，分析昆虫对真菌感染的反应中表达的基因，弄清它们的功能和作用。.采用真菌感染后东亚飞蝗的免疫组织（脂肪体、血细胞）构建了均一化cDNA文库，测序分析发现其中具有免疫相关基因；建立了绿僵菌在蝗虫体表阶段的均一化cDNA文库，大规模测序揭示了病原菌适应寄主体表的机制。通过深度测序，对东亚飞蝗在真菌感染前后免疫组织（脂肪体、血细胞）进行了全表达谱分析，确定出了东亚飞蝗感病后上调表达的基因，其中包含有与免疫反应相关的已知基因和新基因。对东亚飞蝗在真菌感染前后中枢神经系统进行全表达谱分析表明，离子通道蛋白、神经递质受体等神经系统基因的表达也发生了改变。上述研究结果为克隆和鉴定东亚飞蝗防卫病原真菌侵染相关基因奠定基础。本项目采用RNAi等技术鉴定出8个东亚飞蝗基因的功能，发现了东亚飞蝗必需基因和防卫真菌的相关基因6个。建立了多基因表达快速检测的新方法（MgC-GEP法），该方法比定量PCR方法（real-time RT-PCR）和基因芯片更加准确、经济、简便，特别适合中等通量的基因转录分析。采用该方法分析Toll Pathway的8个基因在东亚飞蝗不同组织的表达特征，在国内外首次发现昆虫能够通过Toll Pathway感知病原真菌在其体表萌发，可快速启动多个组织协同参与抵抗真菌感染。真菌的胞壁成分Laminarin和 Chitosan能够通过寄主体表诱导Toll Pathway信号传导，可能是昆虫感知病原真菌在其体表萌发的原因之一。阐明了Lmβgrp基因在东亚飞蝗防卫病原微生物中的作用，Lmβgrp基因及下游酚氧化酶信号通路中酚氧化酶蛋白基因（Lmppo）在绿僵菌侵染过程中均上调表达，RNA干扰Lmβgrp基因的转录后，东亚飞蝗肠道菌群改变，存活率和抗真菌侵染的能力降低，Lmβgrp不仅通过酚氧化酶信号在昆虫抵抗真菌感染中起着重要作用，而且还也可能参与宿主昆虫东亚飞蝗的肠道固有免疫应答反应。本项目鉴定的必需基因为杀虫靶标基因，构建了能够合成蝗虫必需基因dsRNA的绿僵菌，在真菌侵染过程工程菌株合成的dsRNA能够干扰寄主昆虫必需基因转录，极大地提高了菌株毒力，因此，建立针对杀