Fad24启动DFAT细胞成脂再分化和成肌转分化与KLFs转录调控的相关性研究

This research aims to confirm that Fad24, a common switch protein for adipogenic redifferentiation and myogenic transdifferentiation of DFAT cells and regulated by the different upstream transcription factors of the KLFs family members, can cause the differences of the modifications and activities post-translation and the choices and functions of downstream target genes, and make the DFAT cells differentiation in different directions. This study will apply cell culture, induced differentiation, immunocytochemistry, confocal fluorescence microscope, fluorescence quantitative RT-PCR, exogenous gene transfection, a series of 5-deletions and fixed point mutations of promoter activity region, dual luciferase report gene assay and chromatin immunoprecipitation to clarify three issues: the different function of KLFs to regulate Fad24 expression pattern in two different differentiation pathways; the different function of Fad24 regulated by different KLFs to choose and regulate downstream target genes; and the different KLFs binding sites on the Fad24 gene promoter and their direct combination. These results will reveal the transcription regulation mechanism in DFAT cell redifferentiation and transdifferentiation and lay a theoretical foundation for adipose tissue redifferentiation and transdifferentiation.

本研究旨在证实Fad24作为DFAT细胞的成脂再分化和成肌转分化的共性开关蛋白，受不同上游转录因子KLFs家族成员的调控，引起转录后修饰和活性不同，对下游靶基因的选择和功能不同，使DFAT细胞向不同方向分化。研究拟采用细胞培养、诱导分化、免疫细胞化学、荧光共聚焦显微镜、荧光定量RT-PCR、外源基因转染、启动子活性部位5'端系列删除及定点突变、双荧光素酶报告基因及染色质免疫共沉淀等技术进行分析。通过研究拟阐明三个问题：在两种不同分化途径中，不同KLFs调控Fad24表达模式的功能差异；不同KLFs调控引起的Fad24对下游靶基因的选择与调控的功能差异；Fad24基因启动子上不同KLFs的结合位点及它们直接结合。这些研究结果将揭示DFAT细胞再分化和转分化启动的转录调控机制，能够为脂肪组织的再分化和转分化调控奠定理论基础。

本项目主要进行了几个方面的研究：1）构建猪DFAT和ADSCs细胞系，并进行了诱导分化潜能研究，分离的DFAT和ADSCs细胞的纯化率达90%以上，他们能够分化为成脂、成肌、成骨和成神经细胞；2）成脂和成肌分化早期Fad24表达模式研究，无论是成脂还是成肌诱导分化，Fad24 mRNA表达都是在诱导3h时达到峰值，表明它在诱导的启动阶段发挥重要作用；3）成功构建了Fad24和KLF4过表达载体，分别命名为pcDNA-Fad24和pcDNA-KLF4；4）将pcDNA-Fad24和转染猪DFAT细胞，能够显著提高KLF2和KLF4 mRNA的表达，但没有影响KLF13和KLF15 mRNA表达，说明KLF2和KLF4是Fad24的下游基因；5）将pcDNA-KLF4转染猪DFAT细胞，没有影响Fad24 mRNA表达，但能显著提高KLF2 mRNA的表达，这进一步说明KLF4是Fad24的下游基因，但可能是KLF2的上游基因；6）将pcDNA-Fad24转染猪DFAT细胞，在成脂诱导液中诱导成脂分化，但并没有分化为成脂细胞，而是分化为成骨细胞，这是一个有趣发现，其机制有待于进一步研究；7）构建了细胞移植用的ADSCs细胞膜片，经形态学、组织学、免疫组化、分子生物学和扫描电镜观察，细胞呈多层生长，具有良好的支架结构，并能够促进成骨分化作用；8）构建了猪牙周组织缺损模型，移植了ADSCs接种PLGA支架复合体、ADSCs细胞膜片和人工骨粉等移植物进行比较；9）进行了克隆胚胎发育的调控研究，揭示了双重DNA甲基化修饰、褪黑激素、以及恩链霉素对克隆胚胎发育调控的机制。本项目研究结果对揭示Fad24的生物学特性，DFAT和ADSCs细胞的应用、克隆胚胎发育调控机制的阐明，都具有重要意义。

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