CACNA1A基因CDS区新型突变位点对P/Q型钙离子通道Cav2.1、抑制性GABAA受体功能的影响及在PME发病机制中的作用

The manifestation of the epilepsy syndrome is complex and the accurate diagnosis usually depends on gene detection methods. Progressive Myoclonic Epilepsy (PME) is a rare epilepsy syndrome with insufficient spectrum of gene mutation. We have recently found that a novel mutation of CACNA1A c.6975_6976insCAG in a PME family. The involvement of CACNA1A in the pathogenesis of PME, however, merits further investigation. We aim to test the function of alpha-1A submit of the P/Q-type Cav2.1channel,GABAARγ2 submit of the inhibitory GABAAR, and make an analysis of the distribution of mutant CACNA1A, quantify the expression of the Ryanodine receptor, TH, Calretinin, by using gene clone, gene transfection technique, patch-clamp, molecular biology and immunofluorescence, as well as flow cytometry. Then observe the behavioral changes induced by blue light, by AAV optogenetics technique. We will also cultivate the mutant neuronal cells and further establish the model of mutant rats. Our project may clarify whether the novel mutation in the CDS region of CACNA1A has an effect on the P/Q-type Cav2.1 channel or has involved in the pathogenesis of the PME, which on the long run may help screen new drug targets.

进行性肌阵挛性癫痫（PME）是一种少见的癫痫综合征，有关PME突变基因的谱系研究尚不完善。我们前期家系研究发现新型突变CACNA1Ac.6975_6976insCAG 的存在且位于CDS区，影响氨基酸编码功能，但是否参与PME发病机制尚不明确。为此，本项目拟采取基因克隆及转染技术培养突变型神经元样细胞PC12，建立突变型基因鼠模型；通过分生及流式细胞学，对神经细胞膜P/Q型钙离子通道Cav2.1的alpha-1A亚单位及抑制性神经递质GABAA-R亚单位定量分析，观察细胞周期；膜片钳技术对电压依赖性钙离子通道进行测量；荧免技术对突变鼠脑组织钙离子相关蛋白Ryanodine 受体、TH、Calretinin定量测定；AAV光遗传学技术在体蓝光诱发行为学改变。探讨CACNA1A 基因CDS区新型突变点对P/Q型钙离子通道Cav2.1、抑制性GABAA受体功能的影响及在PME发病机制中的作用。

进行性肌阵挛性癫痫（PME）是一种进行性加重、预后不良的癫痫综合征，与复杂基因突变相关，对其发病机制的研究并借此带来新的精准医疗方法是目前的重要目标。我们前期家系研究发现新型突变CACNA1Ac.6975_6976insCAG 的存在且位于CDS区，影响氨基酸编码功能，但是如何参与PME的发病机制尚不明确。后期相关研究结果发现：PME家系中的新型突变基因CACNA1A的存在，为重复性CAG序列的过量聚集，与PolyQ疾病的发病机制类似，因此推测PME的致病机制是否与PolyQ疾病相关；后期制备了13个PolyQ重复序列的野生型cav2.1（cav2.1wt-q13）和26个PolyQ重复序列的突变型cav2.1（cav2.1mt-q26），并将其导入人神经母细胞瘤细胞株sh-sy5y中，发现：cav2.1mt-q26明显抑制了sh-sy5y细胞的增殖，且存在核移位现象，诱导细胞凋亡；以上均提示PME的致病机制可能与PolyQ重复序列及异常蛋白聚集相关，目前暂无类似的报道。本项目将进一步深入探讨PolyQ蛋白细胞毒性的信号通路，以及其他核内基因调节对PolyQ蛋白的抑制作用，进而从RNA水平探讨了PME的发病机制。利用患者血液、细胞和动物模型，实现从临床到实验室，再回归临床的设计思路，层层递进、全面阐明科学问题，课题具有原创性、探索性。

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