骆驼单域抗体框架区作为小分子抗体通用移植骨架的研究

The limited ability of native antibodies and antibody fragments to penetrate tissues especially solid cancers has stimulated the search for smaller alternatives.Camel Derived VHH（variable domains of the Heavy chain antibody）is the most minimal sized sdAb from natural Ab structure，which having unique properties such as simple and stable structure，high affinity binding and only comprising three CDRs，making them idea scaffold for designing proper antibody mimetics and minisized peptide antibody.Based on a previously obtained VHH antibody(namely NBL42) which only comprise single CDR3 and two frameworks FR3/FR4 but with complete antigen binding ability and lysozyme inhibitory activity, we firstly try to elucidate the molecular mechanism of NBL42-FR3/FR4 as stabe framework by site mutagenesis and 3D structure analysis.Secondly, we evaluate the potential of NBL42-FR3/FR4 as universal CDR3 sequences grafted scafford by accepting and expressing various VHH CDR3 grafted onto NBL42-FR3/FR4 scafford.Thirdly,for recovery novel CDR3 peptide antibody which binding valuable antiens, we construct a CDR3 sequence random mutated NBL42-FR3/FR4 scafford based phage display libriary and screening disease associated antigen such as EGFR specific CDR3 peptide antibodies.Finally，for explorig the application of CDR3 peptide antibody，we selected a EGFR-specific peptide antibody，linked the antibody to the bacterial toxin colicin Ia to create fusion proteins and study its tumor targeting and anti-tumoral activity in vitro and in vivo.The identification and construction of universal scaffold to graft CDR3 loop from various source will have enomous demands in biotechnological and biomedical applications.

由于大分子单抗存在组织穿透能力差等缺点，促使研究者发展基于新的结构骨架的小分子抗体或抗体模拟物。骆驼VHH是目前已知的最小天然结构单域抗体。因其结构简单、性质稳定、具有高亲和力和只具有3个抗原结合区等特性，使得它们在设计抗体模拟物和小分子肽抗体方面成为理想的结构框架。我们以前期得到的一个仅具有CDR3和FR3及FR4、但具有完成抗体功能的VHH抗体NBL42为基础，首先通过定点突变和三维结构分析初步阐明该抗体框架区作为CDR3移植骨架稳定性的分子基础。其次，通过移植不同结构的VHH抗体CDR3序列，评价NBL42框架区作为CDR3通用移植骨架的潜力。第三通过构建和筛选NBL42骨架中CDR3序列随机突变的噬菌体展示文库以获得基于该骨架的CDR3肽抗体。最后研究了基于该骨架并与EGFR特异结合的CDR3肽抗体融合细菌毒素colicin Ia后对体内外肿瘤细胞的靶向抑制作用。

抗体结构和功能的研究是发展小分子基因工程抗体的基础。该项目通过对前期获得的一个仅具有 CDR3和FR3及FR4、但具有完全抗体功能的骆驼来源的抗体NBL42为基础，首先通过定点突变和三维结构分析初步阐明该抗体框架区作为 CDR3 移植骨架稳定性的分子基础。其次，通过移植五个不同结构的 VHH 抗体CDR3 序列，评价 NBL42 框架区作为 CDR3 通用移植骨架的潜力。第三通过构建和筛选NBL42骨架中CDR3序列随机突变的噬菌体展示文库以获得基于该骨架的 CDR3 肽抗体。最后研究了基于该骨架并与CD47特异结合的 CDR3肽抗体与蛙皮素Brevinin-2R融合蛋白对体内外肿瘤细胞的抑制作用。该研究建立了CDR3 移植抗体构建和制备的方法，初步确定了NL42肽抗体框架稳定的三个关键氨基酸位点E71, P79, 和C88。定点突变实验表明C88Y突变使NBL42纳米抗体完全丧失活性，是该抗体结构稳定不可缺少的氨基酸。在对五个CDR3或肽序列进行的亲和力转移中，有三个CDR3移植抗体NBL42-A4CDR3、NBL42-H5CDR3和NBL42-CERX 获得了与亲本抗体相同的抗原结合特异性，而另外两个CDR3移植抗体NBL42-Lys3CDR3和NBL42-B6H12H3CDR3没有获得相应的抗原结合亲和力。这些CDR3移植的初步结果表明，NL42的FR3-FR4尽管具有作为移植框架的潜力，但仅能适应特定CDR3序列的移植，还不能作为一种CDR3 通用移植骨架。另外，通过对NL42-ΔCDR3突变文库的筛选，获得了具有CD47抗原结合作用的CDR3肽抗体NL42-ΔCDR3-5F9。将该抗体蛙皮素Brevinin-2R融合表达，获得了纯化肽抗体细胞毒肽融合蛋白5F9-B2R。该蛋白在体外可以明显抑制食管癌EC9706和卵巢癌Skov 3细胞，但肽抗体5F9及其融合蛋白5F9-B2R在体内并没有显示出预期的抗肿瘤活性。尽管部分研究结果与预期目标不相符，但通过该项研究，使我们明确了仅具有CDR3和两侧框架区的抗体片段也可以具有抗原结合能力，并且具有作为CDR亲和力转移抗体骨架的潜力。这为今后设计该类型的抗体提供了理论基础。今后需要进一步研究在该类型的肽抗体中CDR3和框架区各自在抗原结合中所起的作用。为设计新型抗体提供理论依据。

内容获取失败，请点击重试