基于质谱技术的甲基化DNA氧化衍生物的高灵敏定量分析及其在癌症相关研究中的应用

Recent studies suggested that the three oxidized products of 5-methylcytosine (5-mC), 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), 5-formylcytosine (5-fC) and 5-carboxylcytosine (5-caC) may be the intermediate products during DNA demethylation processing, which opens a new gate for understanding the intricate mechanism of DNA demethylation. In addition, the three oxidized products of 5-methylcytosine are also closely related to cancer formation and differentiation of stem cells. However, due to the limitation of current analytical methods, the quantitative detection of the in-vivo oxidized products of 5-methylcytosine, 5-hmC, 5-fC and 5-caC, is still a challenging task. And different research groups even obtained different results for the measurement of 5-hmC between stem cells and differentiated cells. To circumvent the problem, we are going to establish a highly sensitive, accurate and automated method for the analysis of 5-hmC, 5-fC and 5-caC by coupling hydrophilic monolithic column with ESI-QTOF mass spectrometry in current study. With this system, we can analyze 5-hmC, 5-fC and 5-caC at the same time. And by analyzing the change of the oxidized products of 5-methylcytosine in normal and cancer cells, it will provide a new method for the diagnosis and risk assessment of diseases. In addition, the proposal study will shed insight into the understanding of the formation of cancers.

最新发现的三种甲基化胞嘧啶（5-mC）氧化衍生物，即5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-甲酰胞嘧啶(5-fC)和5-羧基胞嘧啶（5-caC），它们除了可能作为DNA去甲基化过程中的中间产物，还可为癌症研究和干细胞分化提供非常重要的信息。但是由于目前分析检测手段的限制，对体内甲基化DNA氧化衍生物（5-hmC、5-fC、5-caC）的精确定量分析方法仍然不够成熟。在本课题中，我们拟制备亲水性聚合物整体柱，建立基于质谱技术的甲基化DNA氧化衍生物高灵敏度、高精确度的在线富集-整体柱液相色谱-质谱分析的检测体系和气相色谱-质谱分析检测体系，实现一次性同时分离分析检测细胞中全部三种甲基化DNA氧化衍生物（5-hmC、5-fC、5-caC）。通过对甲基化DNA氧化衍生物的定量分析，为干细胞分化机制的阐明、癌症的风险评估、早期预警和诊断、抗癌药物新的作用通路的发现等提供新的实验分析方法。

最新发现的三种甲基化胞嘧啶（5-mC）氧化衍生物，即5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-foC)和5-羧基胞嘧啶（5-caC），它们除了可能作为DNA去甲基化过程中的中间产物，还可为癌症研究和干细胞分化提供非常重要的信息。在本项目中，我们：（1）建立了高灵敏的在线富集-整体柱亲水色谱-质谱联用高灵敏分析DNA甲基化及其氧化衍生物方法，发现DNA羟甲基修饰在癌症患者和衰老个体中显著降低的规律；（2）建立了酶标记-固相萃取-色谱质谱联用高灵敏分析DNA甲基化相关修饰，在多种微生物和植物中鉴定并发现新的DNA甲基化相关修饰类型；（3）建立了多种化学标记-质谱分析用于DNA甲基化及其衍生物的高灵敏分析方法，实现了在普通细胞中的核酸表观遗传修饰的分析鉴定；（4）采用金属氧化物分散固相萃取与稳定同位素标记的策略，结合双中性丢失扫描技术，建立了尿液中修饰核苷的全分析方法，发现多种修饰核苷和癌症发生的相关性；（5）建立了单细胞和循环肿瘤细胞中DNA/RNA甲基化修饰分析方法，发现DNA和RNA胞嘧啶甲基化修饰在循环肿瘤细胞的DNA和RNA中的显著变化规律。在本项目基金的资助下，共发表SCI论文20篇，其中IF>5的通讯作者论文14篇，主要包括Anal Chem (7篇)、Clin Chem (1篇)、Chem-Eur J (1篇)、J Clin Endocrinol Metab (1篇)、TrAC-Trend Anal Chem (2篇)、Sci Rep (2篇)。授权专利一项。研究工作顺利完成了拟定的研究计划。

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