与白蛋白结合的穿膜蛋白用于癌细胞内分子靶向的新药研究

Because of the upcoming patent cliffs and the ease of generic copy production of small molecule-based drugs, biologics (biomolecule-based drugs) have gradually occupied the majority of the top-10 positions in global pharmaceutical sales in recent years, and have continued to gain increasing interest from major drug developers. Important advantages of biomolecule-based drugs include high specificity and precision in molecular targeting and hence fewer side effects and safety concerns. However, development of biologics also faces obstacles such as low plasma stability, short circulation time and poor cell membrane penetration. Recent studies in biological and chemical fields have made significant progresses in these frontier areas. Our proposal takes advantage of a three-helical miniprotein as a scaffold for optimization of its binding to serum albumin with increased blood circulation time and conditional release under mild acidic environment, for improvement of cell membrane penetration by introduction of cationic amino acids in well-distributed topology meanwhile lowering cytotoxicity, and for killing specific cancer cells by suppressing MDM2/MDMX inhibition and reactivating p53 pathway through grafting and screening of p53-like motif on one of its helices. Through this project, we should gain first-hand basic knowledge in the above aspects that are important for future development of a new generation of peptide/protein-based anticancer drugs with integrated long-circulation, membrane penetrating and intracellular molecule-targeted characteristics.

由于化学药的专利悬崖及仿制门槛低等因素，近年来生物技术类药物逐渐占据全球药物销售榜单前十的大部分位置，并日益受到新药研发者的重视。生物分子药物的重要优势在于可以对生物体内的分子靶标实现高特异性的结合和调控，但同时也面临着血浆内稳定性低，循环时间短，不易穿过细胞膜发挥药效等研发障碍。近年来，化学与生物学领域针对这些前沿问题的研究取得了较大的进展。本项目将以一个三螺旋小蛋白为基础架构，通过优化其与人血清白蛋白的结合，提升其血液循环时间，且能在弱酸环境下解离释放；通过其表面引入阳离子电荷及均衡的拓扑分布，改善其穿膜入胞的效果，同时降低细胞毒性；通过在其螺旋结构上嫁接并高通量筛选与致病蛋白质MDMs相互作用的类p53序列，实现对特定癌细胞的杀伤。通过本项目，我们将从上述几个方面积累第一手的基础研究数据，探索长循环超电荷跨膜蛋白用于细胞内分子靶向的新一代蛋白质与多肽类药物的开发潜力。

本项目的背景是生物大分子（特别是蛋白/多肽类分子）药物研发面临的一个普遍性挑战，即跨越细胞膜，实现细胞内的分子靶向治疗的巨大困难。本项目提出了大胆的设想：利用一种含有三个alpha螺旋的小蛋白，对其结构表面氨基酸进行系统性改造，以实现白蛋白结合、跨膜递送、MDM抑制的三重效果，最终通过积累基础研究数据，探索新型的胞内靶向多肽类药物的开发潜力。项目的最大难点是如何在不造成细胞非特异性毒性的基础上，实现足够数量的小蛋白分子的细胞内递送，进而实现对MDM分子的充分抑制，和癌细胞的生长抑制。项目开展了：1）三螺旋小蛋白ABD表面阳离子数量的改造，比较研究不同突变体细胞内化效果，同时比较细胞毒性；2）分别对ABD第一或第二螺旋区进行MDM结合功能的改造，同时通过设计构建mRNA展示文库优选高亲合力结合序列；3）改造过程中验证ABD对白蛋白结合能力的保留。项目成功获得一组具有入胞能力、低细胞毒性、具备10^-8M对MDM2亲合力、10^-10M对HSA亲合力，且在结构稳定性等物化性质上表现良好的小蛋白分子。为提高对上述小蛋白或类似标志物的细胞内递送效率/数量，以达到有效治疗浓度，实现对P53野生型肿瘤细胞的细胞周期的选择性抑制和杀伤，项目重点开展了设计/利用双亲性阳离子多肽，实现对内含体/溶酶体膜的选择性裂解。为此，根据学术界的动态以及工业界领先公司Aileron为P53靶向先导药物ALRN-6924所确立的新方向，项目组开展了膜活性多肽领域的前沿工作，例如基于疏水面调控的赖氨酸裂膜型递送肽开发，基于精氨酸的穿膜型分子细胞毒性机理研究等。成果发表在J Med Chem，J Mater Chem，Biomacromolecules等药物化学，材料化学期刊上，授权或申请4项国家发明专利，培养毕业研究生6名。通过该面上项目的成功开展，项目组得以深入研究蛋白质与生物膜相互作用机理这一重要课题，所获成果对生物大分子/纳米药物的细胞和组织内递送具有普遍意义。

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