转录因子Ptf1a/p48调控爪蛙前肢近-远轴发育及其分子机制研究

The limb bud is an excellent model for studying the molecular mechanisms controlling organogenesis. However, the disputation about the molecular mechanisms patterning the proximodistal (PD) limb bud axis has not been solved. One difficulty is that the current marker genes demarcating the PD axis are not specific enough. The other bottleneck is that so far there is no genetic model available for phocomelia. In an effort to establish gene knockout technology in Xenopus tropicalis using TALENs and CRISPR/Cas9, we found that ptf1a/p48 knockout frogs showed typical phocomelia. Furthermore, we found that ptf1a/p48 is very specifically expressed in the most proximal region of newly formed forelimb buds in Xenopus tropicalis tadpoles. These findings have not been published in any vertebrate models. Thus, the ptf1a/p48 knockout frogs offer a novel model for dissecting the molecular mechanisms governing the PD limb bud axis. Here, we propose three aims to investigate how Ptf1a/p48 controls forelimb PD axis formation. In Aim 1, we will define the effects of ptf1a/p48 knockout or overexpression on the expression of early forelimb bud marker genes. In Aim 2, we will identify co-factors and chromatin binding sites of Ptf1a/p48 in the context of proximal cells of forelimb buds using IP and ChIP methods. In Aim 3, we will define the epistasis of Ptf1a/p48, Tbx5, retinoic acid, and thalidomide with respect to the patterning of the forelimb PD axis. We hope that our study will give hints to identify genetic or environment factors that cause phocomelia in humans and thus can help to prevent or reduce this kind of birth defect.

肢芽发生是一个理想的研究器官发育分子机制的模型，但肢体近-远轴形成的分子机制至今仍存在大的争议，主要原因一是缺乏特异性强的标记基因，二是缺乏理想的单基因敲除短肢遗传模型。我们最近利用TALENs和CRISPR/Cas9技术在热带爪蛙中建立基因敲除平台时发现，转录因子ptf1a/p48敲除的热带爪蛙前肢呈现典型的短肢/海豹肢畸形，进一步检测发现ptf1a/p48的表达仅局限在爪蛙新生前肢芽的近端，这些发现在所有模式动物中尚未见报道。因此，ptf1a/p48敲除热带爪蛙为破解肢体近-远轴形成分子机制带来契机。本课题拟在深入分析ptf1a/p48敲除或过表达爪蛙胚胎中的前肢芽分子表型的基础上，用胚胎学、分子遗传学、以及生物化学的方法来系统地揭示Ptf1a/p48调控爪蛙前肢近-远轴形成的分子机制，以期为寻找造成短肢畸形出生缺陷的遗传和环境等因素提供线索，为预防和降低短肢畸形出生缺陷奠定基础。

短肢畸形出生缺陷严重影响患者生活质量，全面认识调控肢芽发育的核心因子并掌握造成短肢畸形的遗传因素，有助于预防和降低短肢畸形出生缺陷的发生。热带爪蛙转录因子ptf1a/p48 除了在胰腺、眼睛及中枢神经系统中的表达外，特异性地表达在新生前肢芽（发育50-52期）的近端。用TALENs 或CRISPR/Cas9 技术在热带爪蛙中敲除 ptf1a/p48后，发现当代敲除的个体前肢呈现典型的短肢/海豹肢畸形，即前肢上臂变短，而前爪和后肢发育正常。传代后杂合子没有表型，纯合子蝌蚪因缺乏胰腺，在开口进食期（46-47期）陆续死亡，尚无法确定其前肢表型。临床上，人TBX5 R237W点突变造成的心手综合症不影响心脏发育，主要引起不同程度的上臂变短畸形，该突变尚无任何动物模型。我们利用单碱基编辑工具rAPOBEC1-XTEN-Cas9n-UGI-NLS base editor (BE3) 在热带爪蛙中建立了Tbx5 R237W点突变品系，在当代的基因编辑动物中完美地模拟了病人的海豹肢表型，表型与ptf1a/p48敲除的当代个体非常相近。但传代后的表型显示，该点突变属典型的隐性遗传，杂合子个体前肢发育正常，没有重演杂合子病人因单倍体剂量不足造成的表型，纯合子个体完全没有前肢。另外，我们在热带爪蛙中成功建立了非同源依赖性性基因敲入技术，利用该技术建立了热带爪蛙ptf1a/p48-3xHA-tdTomato-pA敲入品系，目前正在优化利用该敲进品系分离不同发育时期的前肢芽、胰腺、眼睛及后脑细胞并通过HA抗体进行免疫共沉淀和质谱分析以及ChIP-seq分析的条件。因超过三分之二的人类遗传疾病是由基因点突变造成的，在热带爪蛙中建立的单碱基修饰技术将非常有助于系统性筛选鉴定新的人类基因组点突变致病的病理及临床意义，为预防和降低包括短肢畸形在内的出生缺陷奠定基础。

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