口蹄疫病毒3C蛋白酶突变体对衣壳前体的剪切活性研究

在口蹄疫病毒3C蛋白酶的11个与宿主细胞mRNA结合的氨基酸位点进行逐一单位点突变基础上，进行累积多位点突变。同源建模结构显示，5～9位点突变能够保持3C蛋白酶的催化中心结构，又对宿主细胞mRNA结合的位点进行了逼近饱和突变。继而构建表达3C蛋白酶多位点突变体大肠杆菌、野生巨大芽孢杆菌表达载体，发现存在复性困难和难于表达的问题。之后构建枯草芽孢杆菌WB800株的表达载体，确认5～9位点3C蛋白酶突变体诱导宿主凋亡能力显著下降，9位点突变体最低。为检测不同累积位点突变体在哺乳动物细胞内对口蹄疫病毒结构蛋白前体P1的剪切活性，分别构建累积5～9位点的3C蛋白酶与P1共表达的转移质粒，与山羊痘病毒共转染MDBK细胞，最终筛选到的9位点突变体3C-P1重组山羊痘病毒能够稳定传代，间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot能检测到P1蛋白，且能够被有效剪切，电镜能够观察到口蹄疫病毒样颗粒。动物免疫实验表明，该重组山羊痘病毒能刺激动物机体产生最高达1:32的中和抗体，免疫持续期约2个月左右。项目执行过程中，申请国家发明专利1项，一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法’；发表CSCD文章1篇，‘表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建；SCI文章1篇，‘Immunogenicity of capsid precursor and nine site-directed mutant of 3C protease of foot-and-mouth disease virus co-expressed by recombinant goatpox virus’；CSCD文章接受1篇，‘口蹄疫病毒VP1蛋白病毒样颗粒构建’；培养硕士研究生2名。