一个新的ARID3A基因变异体与原发性胆汁性胆管炎发病的机制研究

In 2017，a research based in Chinese Han first found that the ARID3A gene (rs10415976) was a novel susceptible locus for primary biliary cholangitis (PBC). Previously, we found that ARID3A had a new gene isoform by RNA-seq, which could start transcription from second promoter regions containing only the last six exons and generate a new mRNA--ARID3Av. Rs10415976 was near the region, it was preliminarily predicted that it could be combined with the transcription factor RXRA. And rs10415976 was associated with the expression level of ARID3Av. Therefore, firstly, by the Luciferase Report System, we assessed the activity of ARID3Av promoter in different cell; secondly, by electrophoretic mobility experiments, we analyzed the combination of RXRA and ARID3Av and the effect of rs10415976, when it came to combining ability; thirdly, by QPCR, we tested the expression level of ARID3Av and ARID3A in different cell subsets; fourthly, in K562, HepG2 cells, we study the effect of ARID3Av overexpression on the expression of target gene. The implementation of this program would help us to deeply understand the mechanism of ARID3A in PBC.

ARID3A基因（rs10415976）是2017年新发现的中国汉族人群原发性胆汁性胆管炎（PBC）的易感位点。前期，本课题组通过RNA-seq测序发现：ARID3A有一个新的基因变异体，其可从第二个启动区启动转录生成仅含有后6个外显子的mRNA--ARID3Av。Rs10415976在此区域附近，初步预测其可结合转录因子RXRA。且rs10415976与ARID3Av表达水平相关。因此，第一，我们通过萤光素酶报告系统，研究ARID3Av启动子在不同细胞中的活性；第二、通过电泳迁移率实验，分析RXRA与ARID3Av的结合及rs10415976对结合能力的影响；第三、分离不同细胞亚群，利用QPCR检测ARID3Av及ARID3A的表达水平；第四、在K562、HepG2细胞中，研究ARID3Av过表达对靶基因表达水平的影响。本课题的开展可促使我们深入了解ARID3A在PBC发病中的作用机理。

前期原发性胆汁性胆管炎（PBC）所发现的均是疾病相关位点，并不是真正意义上的致病位点。这些SNP位点如何调控相关基因的表达，进而影响疾病的发生和发展均有待进一步的研究。大部分（93%）的疾病相关位点均位于基因的荒漠区及内含子区，极少数位于外显子区域。然而，目前PBC的分子遗传学研究较少涉及相关基因位点的生物学功能及分子作用机制的探究。本课题组首先通过候选基因关联分析，纳入了532例PBC患者及694例健康对照，发现 ARID3A （rs10415976）和中国汉族人群的PBC相关[P=0.011, OR(95%CI):1.23(1.05-1.45)]。针对PBC样本，进行ARID3A基因部分区域的Sanger测序，有2例患者（2/241）中发现了突变，此突变位于ARID3A基因第六个外显子区域，其可导致氨基酸的改变，而且dbSNP数据库中未见收录，是一个新的突变。其次，通过CHIP-seq实验，进一步发现了ARID3A基因的编码产物可能与KDM5B、GTF2I、ETS1等基因结合，进而影响KDM5B等基因的表达，参与PBC的发病机制。基于KDM5B基因功能（编码蛋白为组蛋白去甲基化酶）及倍数变化等，我们挑选其作为重要靶基因进一步分析，通过敲除KDM5B基因，再进行转录组测序，我们发现KDM5B基因可以调控一系列基因的表达，主要集中于免疫系统应答、细胞表面分子信号传导过程等。通过下载GEO数据PBC相关数据集GSE93170，经过GSEA分析及STRING数据库等分析发现：IL4，TNFAIP3及SOCS3等基因是PBC的hub 基因，其中IL4在PBC中表达上调（p=0.022），TNFAIP3表达下调（p=3.0E-04）及SOCS3表达下调（p=8.0E-03）。KEGG分析提示TNF信号通路的下调在PBC中有重要的作用。本课题组发表SCI论文两篇，按期完成课题相关任务。

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