植物促生土著链霉菌的人工改良以增强其杀线虫活性

Plant-parasitic nematodes cause serious crop losses worldwide and are among the most important agricultural pests. Soil microorganisms have gained broad attention as its potential to be environmentally friendly agents to control plant-parasitic nematodes. Streptomyces rochei D74, isolated from the soil in western China by Northwest A&F University, exhibits prominent plant growth promotion and disease prevention effects on crops including maize, melon and konjak. Borrelidin, the macrolide secondary metabolite, was isolated and characterized with nematicidal activity from the fermentation broth of D74. We have already established the efficient DNA transformation and site-specific recombination system for D74. Heterologous DNA can be stably integrated at the phiC31 attB site on the chromosome of D74. Because nematodes can easily obtain resistance to pesticides, using microorganisms producing multiple nematicidal compounds will facilitate the biological control of plant-parasitic nematodes. Avermectins are known to be excellent anthelmintic agents with good potency and broad spectrum of activity against a variety of nematodes and anthropod parasites and a low level of side-effects on mammals. In this project, based on our advantages in DNA recombineering, we will engineer indigenous bacteria to produce multiple nematicidal compounds by introducing the avermectins biosynthetic pathway into Streptomyces rochei D74. This will enhance the nematicidal activity of indigenous bacteria and achieve to effectively control plant-parasitic nematodes through sustainable production of highly effective compounds in soil.

植物病原线虫严重危害农业生产，利用土壤微生物防治线虫作为一种环境友好型的生物防治方法受到人们的重视。西北农林科技大学从我国西部土壤中分离筛选的娄彻氏链霉菌D74对玉米、魔芋和甜瓜等农作物具有显著的防病促生功能，而且D74能够产生杀线虫大环内酯类次生代谢产物-borrelidin。本课题组已经建立了D74的高效外源DNA转化技术和位点特异性重组系统，能使外源DNA稳定地整合到染色体的phiC31 attB位点上。鉴于线虫很容易获得抗性，使用能够产生多种杀线虫化合物的微生物更有利于线虫病害的防治。阿维菌素是由阿维链霉菌发酵产生的高效、广谱的农畜两用生物杀虫剂，对多种植物病原线虫都具有很好的杀灭效果。本项目基于本课题组在DNA重组工程技术上的国际领先优势，拟实现阿维菌素在D74中的异源表达，人工构建高效线虫病害防治土著微生物，实现高活性化合物在土壤中的持续释放，以达到经济有效地防治线虫的目的。

利用土壤微生物防治线虫作为一种环境友好型的生物防治方法受到人们的重视。鉴于线虫很容易获得抗性，使用能够产生多种杀线虫化合物的微生物更有利于线虫病害的防治。娄彻氏链霉菌D74对农作物具有显著的防病促生功能。阿维菌素是由阿维链霉菌发酵产生的生物杀虫剂，对多种植物病原线虫都具有很好的杀灭效果。本项目拟实现阿维菌素在D74中的异源表达，人工构建高效线虫病害防治土著链霉菌。首先将阿维菌素原始基因簇导入D74中实现了异源表达。为了提高阿维菌素产量，将阿维链霉菌的四个磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因克隆到D74中，结果使阿维菌素杀线虫活性最高组分B1a的产量提高了1.5倍，达到了30μg/L。为了重构阿维菌素基因簇，进一步提高其表达量，我们开发了高效DNA组装技术，能精准拼接>13个高GC含量DNA片段。成功对阿维菌素基因簇进行了重构，使所有基因均受到链霉菌强启动子的控制，但重构基因簇失去了合成阿维菌素的能力。初步分析原因可能是在重构基因簇中，聚酮合酶中最大的666 kDa AveA2蛋白基因被链霉菌启动子转录，对克隆宿主大肠杆菌产生毒性，导致大肠杆菌对其突变，使其丧失功能。接下来我们尝试利用在大肠杆菌内无活性的链霉菌强启动子来驱动聚酮合酶的表达，以期进一步提高阿维菌素在D74中的产量。由于目前阿维菌素在D74的产量太低，我们未测试工程菌杀线虫活性、工程菌抗线虫病害盆栽试验以及工程菌遗传稳定性试验。此外，我们还测试了多杀菌素高效基因簇在D74中的异源表达，结果D74重组菌株的多杀菌素产量比白色链霉菌J1074低10倍，这说明作为野生土著链霉菌D74表达表达聚酮类天然产物的能力较弱，很可能是其基因组上含有较多内源性聚酮基因簇导致的。接下来，我们计划敲除D74基因组上的聚酮基因簇，评估其作为聚酮类天然产物表达宿主的潜力。以期将娄彻氏链霉菌D74开发为阿维菌素表达的优良宿主，将其用于线虫病害防治。

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