多囊蛋白（PC1）对主动脉夹层血管平滑肌细胞表型转化的影响及其机制研究

在研究过程中，我们获得了32例的正常主动脉标本和 25例的主动脉夹层(AD)标本，用于平滑肌细胞（SMC）的原代培养和组织水平研究。采用酶消化+组织块法获得了原代SMC，通过α-actin和Smoothelin染色鉴定。根据PC1的cDNA序列，设计得到3组PC1基因的干扰序列，通过RT-PCR比较干扰效果，其中shPC1-2对PC1mRNA的干扰效率最高，抑制率60%。通过WB比较对PC1蛋白的干扰效果：其中shPC1-2能够有效地干扰PC1 的蛋白表达，抑制率52%。采用pLVTHM 载体连接干扰序列，完成慢病毒穿梭质粒表达载体的构建；采用Tronolab 公司的慢病毒包装系统进行包装。确定在1:40滴度转染48h时具有较好的抑制效果。收缩型SMC经RNAi后，Real time PCR、WB和IHC检测显示PC1、α-SMA、MHC 和Smoothelin下调表达，Real time PCR、WB和IHC检测显示OPN上调表达。收缩型的SMC经RNAi后，Real time PCR、ELISA检测显示COL1A1和COL3A1上调表达。通过电镜检测到收缩型SMC经RNAi后，向合成型转化。从Addegene 购得人源PC1质粒，完成穿梭质粒pshuttle-CMV-PC1 的构建，细菌内同源重组法构建腺病毒质粒，完成重组腺病毒在293T 细胞中的包装。合成型SMC经转导后，Real time PCR、WB和IHC检测显示PC1、α-SMA、MHC 和Smoothelin上调表达，Real time PCR、WB和IHC检测显示OPN 下调表达。Real time PCR、ELISA检测显示COL1A1和COL3A1下调表达。电镜检测到合成型SMC经转导后，向收缩型转化。通过WB检测到AD来源标本mTOR、S6K和4EBP1等蛋白在整体表达水平上与对照组无明显差异，在磷酸化水平上上调。收缩型SMC在PC1 RNAi后，加入Rapamycin处理，Real time PCR、WB和IHC检测显示PC1、α-SMA MHC 和Smoothelin 不发生明显下调表达；OPN的表达不发生明显上调，Real time PCR、ELISA检测显示COL1A1和COL3A1表达水平不发生明显上调；SMC向合成型转化的趋势不明显。