纤维蛋白原γ链D结构域基因点突变导致遗传性纤维蛋白原缺陷症的分子机制研究

γD domain of fibrinogen (Fg) contains many ligand binding sites, such as ca2+ and thrombin, which are vital to the normal functions of Fg. Our previous researches have been identified three novel mutations (Lys232Thr, Trp208Leu and Thr277Arg) in this domain, which cause congenital fibrinogen deficiency in three families. Protein model analysis speculated that these mutations probably made a change in the electrostatic potential of protein surface, or create a void and cause local refolding in order to close the gap, also may induced glycosylation site that increased instability of the protein. All of those are eventually result in the low concentration of Fg. We plan to construct these three mutant plasmids and express in vitro, purified the mutant protein, then do a series of experiments to find out the mechanism of mutations leading to congenital fibrinogen deficiency. Besides these, Alanine replaced mutants, homologous amino acid substituted mutants and polar/nonpolar exchanged mutants are also be planed to figure out the special function of these amino acids in the γD domain.

纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）γ链D区包含了Ca2+、凝血酶等多个配体的结合位点，对Fg正常功能的发挥至关重要。本研究组前期发现了三例位于γ链D结构域世界首报的氨基酸点突变：Lys232Thr、Trp208Leu及Thr277Arg，均引起先证者及部分家系成员Fg水平显著下降，导致遗传性纤维蛋白原缺陷症。蛋白模型分析发现：这三个突变氨基酸可能通过改变空间位阻、改变氨基酸疏水性、诱发糖基化位点等机制，导致所在蛋白错误折叠、组装异常，继而影响其稳定性或正常分泌，导致血浆Fg水平降低。本项目将通过构建突变体表达质粒，体外表达和纯化突变蛋白，进行一系列实验，深入研究突变后引起Fg含量降低的机制，阐明突变蛋白影响Fg发挥正常止凝血功能的机制。同时通过丙氨酸置换、同源氨基酸置换等突变体的研究，探讨该三个位点在纤维蛋白原γD结构域中的特异性功能，深入了解突变引起纤维蛋白原缺陷症的具体发病机制。

纤维蛋白原（Fibrinogen，Fg）γ链D结构域含了凝血酶、纤溶酶原、组织型纤溶酶原激活物等多个配体的结合位点，与Fg功能发挥密切相关。该结构域位点的基因突变，可导致纤维蛋白原缺陷症，并且影响纤维蛋白原正常结构和功能，引起患者出血、血栓等并发症。本研究探讨了γ链D结构域多个基因突变导致遗传性纤维蛋白原缺陷症的发病机制。首先，我们构建了γ232Thr野生型和γ232Lys突变型表达载体，并成功转染CHO细胞系，从细胞转录、翻译和分泌各个环节进行研究，探讨Lys232Thr点突变的分子机制。结果表明：Lys232Thr突变后，能正常转录及合成纤维蛋白原，但是不能分泌至胞外，导致该家系遗传性低纤维蛋白原血症。其次，我们对一例伴有出血症状，位于γ链D结构域的小片段缺失突变（γAla289_Asp291 del）进行了深入研究。我们纯化了γAla289_Asp291 del突变蛋白，分别以凝血酶和蛇毒作为激活剂，检测其聚集曲线及聚集率。结果发现：突变Fg仅部分参与聚合，导致其聚集率降低、聚集曲线的滞后时间延长及终吸光度值减低。此外，我们用扫描电镜对突变蛋白进行分析，研究突变对Fg结构的影响。结果发现：突变纤维蛋白丝直径变粗、变卷曲，纤维束密度降低、孔间隙变大，提示该缺失突变导致了纤维蛋白结构异常。我们又以tPA和纤溶酶原作为激活剂，进行纤维蛋白溶解试验，发现其纤溶功能正常。可见，毗邻D结构域 “a”聚合位点的γ289-291AFD，对于纤维蛋白原的结构和聚集功能至关重要，其缺失突变导致了遗传性异常低纤维蛋白原血症，与先证者及其母亲出现出血并发症相关。再次，我们发现了一例γ链D结构域Ser313Ile错义突变。发生在该位点的突变已报道有三种类型：Ser313Asn、Ser313Gly和Ser313Arg，分别引起遗传性的低纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症，以及异常低纤维蛋白原血症。本例Ser313Ile引起遗传性低纤维蛋白原血症。可见，位于γ链D结构域突变后的氨基酸侧链，能导致不同类型纤维蛋白原缺陷症。总之，我们通过对上述多例γ链D结构域位点基因突变的研究，揭示了遗传性纤维蛋白原缺陷症的发病机制，建立了凝血因子缺陷症体外表达研究平台。

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