酿酒酵母DNA复制蛋白Mcm10促进复制解旋酶Mcm2-7激活的分子机制

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31800066
  • 项目类别：
    青年科学基金项目
  • 资助金额：
    20.0万
  • 负责人：
    张晶晶
  • 依托单位：
    中国农业大学
  • 学科分类：
    C0104.微生物遗传与生物合成
  • 结题年份：
    2020
  • 批准年份：
    2018
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2019-01-01 至2020-12-31

项目摘要

The initiation of DNA replication is strictly regulated in eukaryotes. The core components of the replicative helicase，Mcm2-7，are loaded as an inactive double hexamer (DH) onto origins，to form the pre-RC during G1 phase. After the formation of pre-RC，the Cdc45，GINS and other replication factors assemble on origins，and the pre-IC is formed. This reaction requires S-CDK and DDK. Once the pre-IC is activated by MCM10 ,DDK and other activators，the active Cdc45-Mcm2-7-GINS complex is formed，and then DNA replication fork is established. So far，the molecular mechanisms of the activation of DNA replicative helicase Mcm2-7 by Mcm10 remains elusive. We’ll resolve structures of the MCM10-DH super complex by cryo-electron microscopy. Combines with genetic and biochemical approaches，mutations of Mcm10-DH interfacial interface will be constructed to explore the relationship between Mcm10-DH conformation and helicase activity，which may shed light on the molecular mechanism of Mcm2-7 activation.
真核生物DNA复制起始受到机体的严格调控。在G1期，复制解旋酶的核心组分Mcm2-7以无活性的双六聚体构象 (double hexamer，DH) 装载到复制原点形成pre-RC。当细胞进入G1/S期，激酶S-CDK和DDK行使其功能，将Cdc45、GINS等DNA复制因子招募至pre-RC形成pre-IC。直至S期，pre-IC在Mcm10、DDK等解旋酶激活因子的作用下，形成具有解旋酶活性的Cdc45-Mcm2-7-GINS (CMG) 复合体，起始DNA复制。迄今，Mcm10激活复制解旋酶的具体机制尚不明确。本项目拟通过冷冻电镜技术解析Mcm10与Mcm2-7双六聚体形成的超复合体（Mcm10-DH）的高分辨率结构。并结合遗传与生化手段，对Mcm10-DH互作界面进行突变或互补分析，探讨Mcm10-DH构象与解旋酶活性之间的关系，将有助于揭示解旋酶Mcm2-7激活的分子机制。

结项摘要

DNA复制是最基本的生物学过程之一，所有生命的生长和繁殖都需要DNA的精确复制和传递。DNA复制研究不仅具有生物学基础理论意义，而且在基因组不稳定性引起的重大疾病的医学研究、诊断和治疗中占有重要地位。.在真核生物DNA复制进程中，复制机器的组装与激活极受到机体的严格调控。在G1期，复制解旋酶的核心组分Mcm2-7（MCM）以无活性的双六聚体构象(double hexamer，DH)装载到复制原点形成pre-RC。当细胞进入G1/S期，激酶S-CDK和DDK行使其功能，将Cdc45、GINS等DNA复制因子招募至pre-RC形成pre-IC。直至S期，pre-IC在Mcm10、DDK等解旋酶激活因子的作用下，形成具有解旋酶活性的Cdc45-Mcm2-7-GINS (CMG) 复合体，起始DNA复制。迄今，Mcm10激活复制解旋酶的具体机制尚不明确。.本研究以酿酒酵母为材料，探究了酵母细胞解旋酶CMG在激活过程中的组分和构象变化。无活性的DH是由两分子的MCM组成，因而为了捕捉到CMG激活过程中的MCM相关的中间态复合体，我们首先在酵母细胞中引入了两分子的Mcm4，并由两个不同的标签进行标记。之后通过双标签串联亲和层析纯化含有两个MCM的复合体。免疫印迹和质谱分析显示，DH在激活过程能够与共激活因子Cdc45、GINS形成一种全新的中间态复合体。通过甘油密度梯度离心实验发现该复合体包含两个MCM、两个Cdc45和两个GINS，我们将其称之为“double-CMG (d-CMG)”。之后，我们借助电镜观察到在MCM相关复合体中有d-CMG存在，但其所占比例较低。此外，在大肠杆菌中过量表达并分离纯化了酵母和人细胞的Mcm10蛋白，并通过分子筛层析发现Mcm10存在单体和多聚体两种状态。我们通过负染和冷冻电镜解析了多聚化Mcm10的结构。结果显示，酵母细胞的Mcm10蛋白可以形成同源六聚体，且六聚体的各亚基均匀排布环成了一个中空的桶装结构。之外，我们还发现人细胞的Mcm10和GINS可以形成稳定的复合体。.本研究发现在DNA复制起始过程中，无活性的解旋酶DH首先组装成d-CMG复合体；随后该复合体迅速转变为两个激活状态的CMG。同时发现解旋酶激活因子Mcm10存在单体和多聚体两种状态，为阐明真核生物DNA复制解旋酶激活的全过程提供了线索。

项目成果

期刊论文数量（2）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Characterization of the dimeric CMG/pre-initiation complex and its transition into DNA replication forks
二聚 CMG/预起始复合物的表征及其向 DNA 复制叉的转变
  • DOI：
    10.1007/s00018-019-03333-9
  • 发表时间：
    2020
  • 期刊：
    Cellular and Molecular Life Sciences
  • 影响因子：
    8
  • 作者：
    Liu Lu;Zhang Yue;Zhang Jingjing;Wang Jian-Hua;Cao Qinhong;Li Zhen;Campbell Judith L.;Dong Meng-Qiu;Lou Huiqiang
  • 通讯作者：
    Lou Huiqiang
Mck1 defines a key S-phase checkpoint effector in response to various degrees of replication threats
Mck1定义了一个关键的S阶段检查点效应器，以应对不同程度的复制威胁
  • DOI：
    10.1371/journal.pgen.1008136
  • 发表时间：
    2019
  • 期刊：
    PLoS Genetics
  • 影响因子：
    4.5
  • 作者：
    Li Xiaoli;Jin Xuejiao;Sharma Sushma;Liu Xiaojing;Zhang Jiaxin;Niu Yanling;Li Jiani;Li Zhen;Zhang Jingjing;Cao Qinhong;Hou Wenya;Du Li-Lin;Liu Beidong;Lou Huiqiang
  • 通讯作者：
    Lou Huiqiang

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  • 期刊：
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  • 作者：
    张晶晶;吴鹏;曹琪;凌晨
  • 通讯作者：
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  • 期刊：
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  • 作者：
    张羽云;何永梅;杜婷婷;张晶晶;周苑博;武树义;范厚东;裴海霞
  • 通讯作者：
    裴海霞

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
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