基于单分子测序的幽门螺杆菌宿主内多样性和微进化研究

Intrahost diversity or heterogeneity of microorganisms recently arises big interests of worldwide researchers. We previously investigated the diversity and evolution of viruses and bacteria by using high-throughput sequencing. In this proposal, we plan to use single molecule sequencing technology and high-throughput sequencing to study the intrahost heterogeneity of Helicobacter pylori (Hp) colony. Novel algorithm and bioinformatics tool will be developed to recover the single-clone level whole genome sequences and relative abundances from HP colony with heterogeneity. As antibiotic resistance is the main problem in HP therapy, we collected Hp samples with different drug resistance from the same patients, and apply the new method for a comprehensive analysis of Hp phylogenetics, genomics, and evolutionary biology. We will reconstruct the micro-evolutionary history of the intrahost Hp clones, and explore the dynamics of drug resistance emergences. The methodology developped in this research could also be applied to studies of other microorganisms and metagenomes.

微生物的宿主体多样性或异质性，近年来引起了科学界的广泛关注。我们前期基于高通量测序技术，在该方向有一定的研究基础。本课题选择幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）为研究对象，建立新方法，系统揭示Hp的宿主内多样性和微进化规律。由于耐药是Hp感染根除治疗失败的主要问题，我们还收集了同一宿主不同部位（胃窦小弯，胃窦大弯、胃体、胃角）存在不同耐药性的Hp菌落。我们拟对Hp菌落同时进行单分子测序和高通量测序，然后根据实际数据构建生物信息学方法，直接获得样本中单克隆水平的全基因组序列和相对丰度，实现对菌落异质性的高精度基因组学解析。基于该数据，可对Hp进行全面的系统发育和微进化分析，发现Hp在宿主内的突变/重组规律，并直接观测耐药位点在Hp克隆中的产生过程。总的来说，本课题拟建立单克隆水平的菌落分析新方法，系统研究Hp在宿主内的异质性，对其他细菌的相关研究亦有借鉴意义。

本研究选择了具有胃部多个部位分离培养幽门螺旋杆菌样本的病例为研究对象，并分为了对左氧氟沙星和克拉霉素有耐药差异租（14人，41份样本）及无耐药差异组（11人，31份样本）。利用下一代测序（NGS）和单分子测序技术相结合的方案对幽门螺旋杆菌培养菌液（未经过连续传代）进行全基因组测序，获得了一致性（consensus）基因组，并构建了基于全基因组的系统发生树。在一致性基因组水平，发现存在一个多重感染的病例，即胃不同部位定植有不同的菌株，且分别属于东亚谱系（hspEAsia）与欧洲谱系（hpEurope）。在进行亚克隆水平的深入分析后，发现了另一个病例也存在副克隆级别的多重感染。其他病例的宿主内多样性相比较低，可认为多样性来自于宿主内微进化。通过比较分析发现，在一致性序列分析水平和亚克隆分析水平上，有耐药差异病例组的菌株宿主内多样性在统计上均显著高于无耐药差异病例组。为了进一步细致地分析幽门螺旋杆菌宿主内多样性，本研究将NGS和PacBio测序数据联用，实现了亚克隆级别的宿主内突变位点的定相（phasing），在亚克隆单倍型水平刻画了幽门螺旋杆菌宿主内基因组图谱。结果表明，排除多重感染样本后，重组导致的突变在幽门螺旋杆菌宿主多样性形成中占据绝对主导地位。在宿主内差异突变数超过400的16个样本中，重组贡献的突变占比保守估计为94.5%。通过对来自重组的突变进行供体追溯，并进行可视化，获得了重组区域块的长度分布，其中位长度为445bp。进一步，本研究重点研究了左氧氟沙星耐药相关gyrA基因和克拉霉素耐药相关23S rRNA基因。在两个病例中直接观测到了gyrA的耐药突变由于重组形成不同的亚克隆。另外，在病例P4中也发现了23S rRNA基因上耐药突变来自重组的迹象。总的来说，本研究基于NGS和长片段测序联用的手段，通过分析方法学的创新，首次实现了亚克隆单倍型水平的幽门螺旋杆菌微进化基因组分析，获得了高精度的宿主内基因组图谱。结果表明，重组是幽门螺旋杆菌宿主内多样性的主要产生机制，并可能导致同一宿主的不同克隆产生耐药性差异，这增加了对幽门螺旋杆菌微进化的认识。

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