粗裂地钱木质素生物合成关键酶基因MpC3'H的克隆及功能研究

The appearance of lignin during evolution is a crucial adaptation for plants to live from an aqueous to a non-aquatic environment, and bryophytes pioneered the colonization of terrestrial habitats. The moss Physcomitrella patens was considered to be the first to show the complete lignin biosynthesis pathway, but it is lignin-free, and its p-coumaroyl ester 3'-hydroxylase (C3'H), the key enzyme of this pathway, controls the cuticle rather than lignin synthesis. Studies have shown that the most basal liverworts contain lignin components, but their C3'H genes have never been cloned and identified. A search of the transcriptome sequence datasets for Marchantia paleacea identified a candidate C3'H homolog MpC3'H. Its sequence and promoter were analyzed, and it could be clearly responded to phytohormone treatment. This project intends to study the spatiotemporal expression pattern of MpC3'H; the physiological, biochemical and metabolites changes will be analyzed to identify the functions of the enzyme in both knock-down transgenic M. paleacea and overexpressed Arabidopsis ref8 mutant; substrates screening and biochemical analyses will be carried out by heterologous expression of MpC3'H in yeast; meanwhile, subcellular localization will also be analyzed. This research is helpful to elucidate the function and mechanism of MpC3'H from in vivo and in vitro, and to explore the evolutionary status of MpC3'H.

木质素的出现在植物由水生向陆生转变中作用关键，苔藓植物正处于此过渡态。此前的研究认为小立碗藓是最早出现完整木质素生物合成途径的物种，但其不含木质素，且该途径的关键酶香豆酰酯-3'-羟化酶（C3'H）参与角质而非木质素合成；而最为基础的苔类中含有木质素成分，但其C3'H基因还从未被克隆鉴定过。前期筛选粗裂地钱转录组数据库得到一个可能的MpC3'H基因，并对其序列和启动子进行了分析，实验发现它能被植物激素诱导表达。本项目拟通过克隆基因启动子，研究其时空表达模式；克隆基因全长，构建RNAi和过表达植物载体，分别转入苔类组织和拟南芥ref8突变体，对引起的生理生化及代谢产物变化进行分析，鉴定关键酶在非维管和维管植物中的功能；对基因进行酵母异源表达，根据体内功能筛选鉴定催化底物，研究反应特点；同时分析基因亚细胞定位，以期从体内外阐明MpC3'H的功能及作用机制，并探讨苔类植物C3'H基因的进化地位。

苔藓是原始的陆生植物，木质素的出现被认为是植物由水生向陆生转变的关键因素，因此项目对苔藓植物中木质素合成关键酶基因进行了克隆鉴定。苔藓生命主导阶段是单倍体，作为遗传转化材料具有优势，筛选得到了钝鳞紫背苔和浮苔叶状体无菌培养与诱导愈伤组织的最佳条件，建立了两种苔类植物完整的无菌再生体系，为后续相关实验奠定了基础。从地钱中克隆了C3'H基因的启动子，通过构建启动子缺失片段的表达载体，确定了转录起始位点及核心启动子区域，发现其转录起始位点的位置具有特殊性，并获得了一个具有潜在应用价值的较强启动活性的启动子片段。构建了顺式作用元件缺失的启动子转化地钱叶状体进行基因表达模式研究。从苔藓植物及江南卷柏中克隆了4个C3'H基因，亚细胞定位实验显示C3'Hs位于内质网。对其进行了密码子优化并转化酵母，构建了植物过表达载体转化地钱叶状体，进行体内体外功能研究。从芽胞角苔克隆了1个HCT基因，进化分析显示角苔类HCT可能与苔类HCT具有不同的进化起源。亚细胞定位显示其定位在细胞质和细胞核。活性鉴定其具有酰基转移功能，莽草酸为其最适酰基受体，p-coumaroyl-CoA为最适酰基供体，二者反应时具最高催化效率。该项目建立了苔类植物的无菌培养体系，并研究了苔藓木质素合成关键酶及启动子活性，为阐明陆生植物木质素的起源具有重要意义。

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