对硝基苯甲酸选择性抑制分枝杆菌生长机制的研究

目前在全球应用最为普遍的鉴别结核分枝杆菌复合群（MTC）与非结核分枝杆菌（NTM）的方法是含对硝基苯甲(PNB)的鉴别培养基法。但关于PNB选择性培养基用于鉴别MTC与NTM的机制研究报道甚少。.本研究选取了38株不同种的分枝杆菌标准菌株，应用HPLC和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对PNB的代谢产物进行鉴定，结果发现对氨基苯甲酸（PABA）是PNB的代谢产物之一。本研究中的所有NTM菌株均可将PNB还原为PABA，而MTC则不具备该能力。快速鉴别MTC与NTM对结核病的诊治具有重要意义，但常规的实验室方法费时费力。依托本课题建立了一种简便、廉价的应用分光光度计直接测量PNB代谢产物来鉴别MTC与NTM的方法。并应用此方法对38株MTC与NTM的标准株和65株临床分离株（包含10种分枝杆菌）对该方法进行了评价。结果表明应用分光光度计检测PABA来鉴定MTC与NTM具有100%的敏感性和100%的特异性。.关于硝基苯甲酸还原酶的编码基因，在各种分枝杆菌中还未进行基因定位，本研究采用生物信息学方法对脓肿分枝杆菌中被注释为“putative nitroreductase”的基因进行了预测分析，结果显示该基因编码219个氨基酸；对应的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质（不稳定系数为54.52，总平均亲水性为-0.244）；理论分子量和等电点分别为24.38 KDa和6.52；蛋白质二级结构以 -螺旋、 -折叠和无规卷曲为主要构件；氨基酸序列与蛋白质结构数据库中3gr3蛋白A链的相似性最高为60%，空间结构预测表明该蛋白是硝基还原酶家族成员之一，可能具有还原对硝基苯甲酸的功能。.利用大肠杆菌表达系统对“putative nitroreductase”基因进行了体外表达，目的蛋白以包涵体形式存在；采用亲和层析方法对包涵体蛋白进行了纯化，并通过透析复性处理，得到了可溶性的目的蛋白；灰度扫描分析结果显示其纯度为89.6%；Western blot结果显示在约30KDa处得到了显色带，且特异性较好；BCA蛋白定量法测得其浓度为0.59 μg/μL；酶的比活力为32.2U/mg。.总之，本研究确定了PNB选择性培养基用于鉴别MTC与NTM的机制，并确定了脓肿分枝杆菌中“putative nitroreductase”基因的硝基苯甲酸还原酶活性。