调控Keap1与Nrf2相互作用的Keap1蛋白未知磷酸化位点及磷酸化信号传导通路研究
结题报告
批准号:
31460226
项目类别:
地区科学基金项目
资助金额:
53.0 万元
负责人:
王大勇
依托单位:
学科分类:
C0502.分子生物物理
结题年份:
2018
批准年份:
2014
项目状态:
已结题
项目参与者:
韦双双、裴业春、黄永林、韩杰
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中文摘要
Keap1蛋白对细胞内Nrf2蛋白水平的调节是生物体内调节氧化还原稳态水平的主要方式。转录因子Nrf2通过与抗氧化反应元件(ARE)结合,诱导100多种基因的表达;Nrf2与其胞内抑制物Keap1结合后迅即发生泛素依赖性降解。现有研究表明,Keap1与Nrf2的分离过程对氧化应激不敏感,可能需要细胞内的蛋白质磷酸化信号系统参与调控Keap1与Nrf2的相互作用,但目前尚未发现细胞内磷酸化信号系统调节Keap1与Nrf2相互作用的方式。本项目假设,Keap1蛋白上的特定氨基酸位点磷酸化可以调节Keap1与Nrf2的相互结合,从而影响Nrf2-ARE信号传导。本项目采用分子生物学、质谱分析和生物化学等直接的实验方法研究分析具有上述调节功能的人Keap1磷酸化位点及主要信号传导通路,为抗氧化、抗炎、组织再生、生长发育、预防肿瘤、抗衰老、以及老年痴呆等基础和应用研究提供确切的依据。
英文摘要
The regulation of Keap1 on intracellular level of Nrf2 is the most important mechanism regulating redox homeostasis in a living organism. Nrf2, which is a transcription factor, regulates the expression of more than 100 genes by binding to antioxidant response element (ARE); it is rapidly degradated in a ubiquitin-dependent manner after binding to its endogenous inhibitor Keap1.The separation of Keap1 from Nrf2 is not sensitive to oxidative stress, and intracellular phosphorylation-signaling system may involved in regulating the separation, however, the signal regulating process has not been elucidated yet. It is hypothesized in the proposal that there are special amino residues that can be phosphorylated to regulate the binding of Keap1 to Nrf2, which in turn influence the signal transduction from Nrf2 to ARE. In the proposal, direct approaches involving molecular biological, mass spectrometric and biochemical methods will be employed to identify the phosphorylation sites on Keap1 and its upstream signaling pathways. The study will benefit basic and new medicine-related studies on antioxidation,anti-inflammation, tissue regeneration, growth and development, prevention of carcinogenesis, anti-aging, and prevention of Alzheimer's diseases.
Nrf2是细胞应激反应中的重要转录因子,能诱导抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达。越来越多的研究发现了Nrf2在人体衰老过程以及保护我们的身体免受药物毒性和压力诱发的疾病中所起的作用。Keap1- Nrf2-ARE(Antioxidant response element)信号通路的分子基础的研究对预防疾病的发生、治疗疾病以及解决耐药性至关重要。已有研究指出,Keap1的一些修饰影响Keap1与Nrf2的相互作用,从而影响ARE介导的基因表达。Keap1的Cys残基可能作为氧化和亲电压力的传感器影响Nrf2和Keap1的相互作用。目前尚无Keap1磷酸化位点的确切报道,并且Keap1蛋白磷酸化对Keap1与Nrf2的相互作用尚不明确。我们利用人源细胞,研究在氧化应激时Keap1有哪些位点发生修饰,以及模拟磷酸化修饰对Keap1与Nrf2的相互作用的影响。.首先构建真核表达载体转染HEK293细胞,表达Halo-Keap1融合蛋白。用400 μM H2O2刺激后,从细胞中纯化Keap1蛋白。利用质谱法鉴定Keap1蛋白的磷酸化位点。针对质谱法鉴定出的Keap1蛋白磷酸化位点之后,利用点突变技术表达模拟磷酸化Keap1蛋白,通过多种实验研究其对Keap1和Nrf2的相互作用以及Nrf2细胞核迁移的影响,包括Halo标签Pulldown实验、酵母双杂实验、凝胶电泳迁移实验、qRT-PCR实验、蛋白质结构建模等。.质谱分析显示S53和S293氨基酸残基在氧化应激条件下发生磷酸化。Ser53位点保守性较高,S53突变为谷氨酸(E)模拟磷酸化带负电荷,抑制Keap1与Nrf2相互作用,促进Nrf2入核,诱导抗氧化基因表达。蛋白结构建模及动力学模拟显示,S53突变为E53后,可与第50位精氨酸残基形成离子键,Keap1蛋白氨基末端构象发生变化。该研究发现了Keap1蛋白新的潜在磷酸化位点,可以调节Keap1-Nrf2信号通路依赖性抗氧化基因的表达。该项目为深入研究Keap1-Nrf2- ARE信号通路相关研究奠定基础,为研发新的针对Keap1-Nrf2这一重要抗氧化通路的抗衰老药物提供细胞生物学依据。
期刊论文列表
专著列表
科研奖励列表
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Role of human Keap1 S53 and S293 residues in modulating the binding of Keap1 to Nrf2
人 Keap1 S53 和 S293 残基在调节 Keap1 与 Nrf2 结合中的作用
DOI:10.1016/j.biochi.2018.12.008
发表时间:2019-03-01
期刊:BIOCHIMIE
影响因子:3.9
作者:Wei, Shuangshuang;Pei, Yechun;Wang, Dayong
通讯作者:Wang, Dayong
Profiling of Differential Expression of Genes in Mice Carrying Both Mutant Presenilin 1 and Amyloid Precursor Protein Transgenes with or without Knockout of Β2 Adrenergic Receptor Gene
携带突变早老素 1 和淀粉样前体蛋白转基因(敲除或不敲除 α2 肾上腺素受体基因)的小鼠中基因差异表达的分析
DOI:10.4172/2329-9533.1000155
发表时间:2018
期刊:Journal of Applied Bioinformatics and Computational Biology
影响因子:--
作者:Yuan Zhou;Lintao Chen;Xi Zhou;Yechun Pei;Shuangshuang Wei;Anum Mehmood;Yang K. Xiang;Dayong Wang
通讯作者:Dayong Wang
Transcriptomic analysis of gene expression in mice treated with troxerutin.
曲克芦丁治疗小鼠基因表达的转录组分析
DOI:10.1371/journal.pone.0188261
发表时间:2017
期刊:PloS one
影响因子:3.7
作者:Wang Y;Wei S;Chen L;Pei J;Wu H;Pei Y;Chen Y;Wang D
通讯作者:Wang D
DOI:10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.017
发表时间:2018
期刊:热带作物学报
影响因子:--
作者:陈林涛;韦双双;黄永林;吴昊;郭子怡;陈银华;王大勇
通讯作者:王大勇
Stability and Pharmacological Effects of Gene-Recombinant Wild Type and Mutant Human Adrenocorticotropic Hormone.
基因重组野生型和突变型人促肾上腺皮质激素的稳定性和药理作用。
DOI:10.1007/s11095-017-2107-5
发表时间:2017
期刊:Pharmarmaceutical Research
影响因子:--
作者:Yonglin Huang;Yechun Pei;Huai Guan;Shuangshuang Wei;Hao Wu;Yuan Zhou;Jinli Pei;Lintao Chen;Yuerong Wang;Yibo Chen;Qian Han;Daming Wang;Dayong Wang
通讯作者:Dayong Wang
SIRT6-Nrf2蛋白质相互作用与调控及其对基因表达的影响研究
  • 批准号:
    32160214
  • 项目类别:
    地区科学基金项目
  • 资助金额:
    36万元
  • 批准年份:
    2021
  • 负责人:
    王大勇
  • 依托单位:
与β淀粉样蛋白单体相互作用引起JNK-Tau磷酸化的未知蛋白及其介导的细胞信号传导通路研究
  • 批准号:
    31760246
  • 项目类别:
    地区科学基金项目
  • 资助金额:
    38.0万元
  • 批准年份:
    2017
  • 负责人:
    王大勇
  • 依托单位:
国内基金
海外基金