靶向下调VGLUT2基因对痛觉信息传递的影响及其机制的研究

本项目利用表达针对VGLUT2基因的小干扰RNA的慢病毒载体，高效转染至脊髓背角神经元，实现有效下调其内VGLUT2靶基因的表达，并综合运用行为学、形态学、分子生物学和电生理学方法，检测了VGLUT2的下调对外周痛觉信息传递的影响。主要结果如下：（1）成功构建表达VGLUT2的载体, 设计siRNA序列，在体外完成了对有效降低VGLUT2的siRNA序列的筛选，并将其成功插入到慢病毒载体内。（2）成功地将VGLUT2-shRNA重组慢病毒载体转染原代培养的脊髓神经元，在体外验证该重组病毒能够高效下调其神经元内目的基因VGLUT2的表达。（3）成功将在体外有效降低VGLUT2的重组慢病毒载体，定位注射至大鼠脊髓背角浅层，感染背角神经元，并成功下调其内的VGLUT2的表达；行为学检测结果显示可以明显缓解神经病理性痛模型大鼠的机械性痛敏。（4）利用neurobiotin和VGLUT2抗体成功地区分出脊髓背角中VGLUT2的来源分布，为进一步研究DRG（初级神经元）与脊髓背角（二级神经元）中VGLUT2参与疼痛机制的研究提供了新的方法。（5）综合运用多种技术，首次在国际上报道了表达VGLUT1与VGLUT2 mRNA的谷氨酸能神经元在三叉神经感觉核簇（TSNC）内呈互补分布，这两群神经元分别向小脑和丘脑发出投射，提示二者分别负责口面部信息向丘脑和小脑的传递。该结果为TSNC内三叉-丘脑和三叉-小脑投射通路中VGLUT1和VGLUT2 mRNA表达神经元的定位分布、VGLUT1和VGLUT2免疫阳性轴突终末定位投射的终止部位提供了直接的形态学依据。成果发表在国际著名杂志Brain Struct Funct，2014; 219: 211-229上（IF=7.837）。（6）对腰膨大部位脊髓薄片培养神经元转染VGLUT2-shRNA重组慢病毒后，通过脑片膜片钳技术观察到脊髓背角感染神经元的自发性兴奋性突触后电流 (sEPSC) 的幅度较对照组（空病毒组）减小，频率降低。该结果证明下调脊髓背角内VGLUT2的表达可对其神经元的电生理学特性产生抑制性影响。本课题较好的阐明了脊髓背角内VGLUT2是影响外周神经病理性痛传递的重要物质，慢病毒介导的shRNA 干扰技术可特异性下调VGLUT2的表达，从而为临床上开发新的以VGLUT2为分子靶点对疼痛的有效基因治疗奠定了重要的理论基础。