基于ICC自噬研究健脾清肠方调控DSS诱导结肠炎小鼠肠道运动功能的机制

As a new direction in the pathogenesis of ulcerative colitis (UC), the role of intestinal motility is being recognized and becoming a hotspot.The abnormal of ICC autophagy is an important approach. Our previous study indicated that the initial Jian Pi Qing Chang decoction(JPQC) could alleviate and repair the injured ICC, increase the frequencey and amplitude of contraction wave of smooth muscle, which might be involved in regulating intestinal motility of TNBS-induced colitis in rat. We design the issue with DSS-induced colitis in mice, asses the colitis activity index, histopathology of colonic tissue, the level of IL-1 β, IL-10, IFN- γ and NF- κB of colonic tissue, the ultrastructure of ICC autophagsome, c-kit,LC3-II, Beclin-l protein expression and colonic smooth muscle contraction in vivo study intervened by JPQC decoction; analyse on the regulation effect by medicated serum with JPQC decoction on ICC autophagy induced by rapamycin in vitro study,detect LC3-II,Beclin-l, c-kit,PI3k,Akt,mTOR protein expression, the ultrastructure of ICC autophagosome, cell cycle, the calcium current. We want to clarify the mechanism that: JPQC decoction could regulate the intestinal motility of UC by suppressing ICC excessive autophagy through PI3K-Akt-mTOR signal pathway. It is very likely to provide a strong scientific basis for the clinical application and promotion of the drug.

肠道动力紊乱与溃疡性结肠炎(UC)的发病关系是研究的热点之一， ICC自噬异常是其关键环节。我们前期研究证实：健脾清肠方初始方通过减轻和修复TNBS诱导结肠炎大鼠结肠ICC损伤，恢复ICC数量调节肠道动力。本课题用DSS诱导结肠炎小鼠模型，体内实验观察健脾清肠方对结肠炎活动指数，结肠组织病理，结肠组织IL-1β、IL-10、IFN-γ和NF-κB含量，ICC自噬体超微结构，c-kit、LC3-II、Beclin-l蛋白表达及结肠平滑肌收缩运动的影响；体外实验研究健脾清肠方含药血清对雷帕霉素诱导ICC自噬的调控作用，检测其LC3-II、Beclin-l、c-kit、PI3k、Akt、mTOR蛋白表达，自噬小体，细胞周期，钙离子浓度，证明健脾清肠方通过调控PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制ICC过度自噬，调节肠道动力学的作用机制，为临床运用健脾清肠方治疗UC提供科学基础数据及新的治疗靶点。

目的：探讨健脾清肠方（JQD）对DSS诱导结肠炎小鼠肠道动力的作用机制。方法： C57BL/6小鼠随机分为Control组、DSS组、JQD组、5-ASA组。除Control组外，余各组小鼠用5%DSS自由饮用诱导结肠炎模型，造模7 d后灌胃给药。第15天处死小鼠收集结肠组织，检测结肠组织病理学，ICC的超微结构，结肠组织IL-1β、IL-10、IFN-γ、TNF-α含量， c-kit mRNA、LC3-II mRNA、Beclin-l mRNA、NF-κB p65表达和结肠平滑肌张力。体外培养小鼠小肠ICC并鉴定，制备JQD-CS，MTT检测不同浓度JQD-CS对ICC的增殖作用。雷帕霉素诱导ICC自噬，用JQD-CS，分为Blank组、Rapamycin组、5%JQD-CS、20%JQD-CS组、Rapamycin+3-MA组。观察ICC的超微结构，RT-PCR法、Western blotting法检测LC3-II、Beclin-l、c-kit、PI-3k、Akt、mTOR蛋白表达，检测ICC细胞周期，检测Ca2+内流。结果：与DSS组比较，JQD组结肠黏膜表面上皮细胞移行修复，少量炎症细胞浸润，黏膜腺体基本恢复正常；ICC与其他细胞间连接完好，内部细胞器结构相对完整，可见到少量自噬泡存在；结肠组织IL-1β、TNF-α含量降低，IL-10、IFN-γ含量上升；c-kit mRNA表达上调，LC-3II mRNA、Beclin-1 mRNA 、NF-κB p65表达下降；结肠平滑肌条收缩振幅上升、收缩频率减少。适度浓度（≤20%）的JQD-CS，ICC的OD值随着含药血清浓度的增加而升高。与Rapamycin组相比，20%JQD-CS组ICC细胞结构较完整，可见少量自噬泡；LC-3II、Beclin-1表达下降，c-kit、p-PI3K，p-AKT表达增加；Ca2+最大电流密度值降低；G2周期比例减少，G1+S周期比例增加。结论： JQD可能是通过抑制NF-κB/TNF-α通路及调节细胞因子IL-1β、IL-10、IFN-γ表达，抑制了肠道炎症的级联放大反应；抑制Rapamycin诱导ICC自噬的Ca2+内流，调控PI3K/Akt信号通路的磷酸化，调节细胞周期，促进增殖分化，抑制ICC过度自噬，调控ICC/SMC网络通路，从而调节动力学异常。

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