外源β-胡萝卜素基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径中关键酶的影响

课题组通过改变β-胡萝卜素基因拷贝数获得了多株β-胡萝卜素合成水平差异的菌株，并利用代谢工程的策略进一步提高了其合成水平, 已经获得了多株代谢差异显著的重组菌株（17株），最高和最低β-胡萝卜素水平相差7.6倍。但同时发现，随着产物水平的提高，细胞生长受到的抑制作用逐渐增强。.（1）ERG20基因是关键酶基因，其表达水平随着目的产物合成水平的增加而提高；.（2）通过基因调控显著提高β-胡萝卜素合成水平：1）增加β-胡萝卜素基因拷贝数能够显著提高β-胡萝卜素合成水平，同时增加麦角固醇水平。随着产物水平增加，各个关键酶表达水平都有不同程度的提高，但细胞生长受到的抑制作用增加；过量表达关键酶基因HMG1或ERG20能够提高β-胡萝卜素水平，但高表达ERG20基因对细胞生长的抑制作用更加强烈；2）过量表达HMG1基因，同时抑制麦角固醇合成，以及利用甲羟戊酸途径代谢活跃的工业葡萄酒酵母菌作为宿主菌，能够显著提高β-胡萝卜素水平；.（3）利用发酵条件优化技术提高β-胡萝卜素合成水平：调控pH和温度将β-胡萝卜素产率提高到50.4 mg/L，据申请人所知，这是目前报道的利用酿酒酵母作为宿主菌合成β-胡萝卜素的最高水平;.（4）在项目实施过程中，建立了完善的代谢产物检测技术，包括糖代谢产物、类胡萝卜素、麦角固醇、乙酰辅酶A等物质；.（5）通过基因敲除研究重组菌在环境胁迫条件下的代谢变化：利用loxp-Kanmx4-loxp基因敲除法，敲除了编码过氧化氢酶的基因CTT1，研究β-胡萝卜素和抗氧化物酶在抵抗过氧化氢胁迫中的不同作用;.（6）建立了高效的类胡萝卜素高产重组菌快速筛选技术。通过平板初筛和摇瓶培养复筛可以快速、准确的筛选到细胞生长和β-胡萝卜素合成水平显著差异的菌株。. 根据已经得到的结果，我们认为，对于甲羟戊酸途径的调控，多基因协同调控更加有效，因为调控单个关键酶虽然能够提高产物水平，但由于中间产物的积累（其具有毒性），细胞生长都受到不同程度抑制。因此，下一步的工作主要是对各个关键酶进行协同精细调控，以避免中间代谢产物的积累，进一步提高类胡萝卜素物质的合成水平，从而阐明微生物细胞调控类胡萝卜素合成的分子机制。