可安全稳定高效降解环境雌激素的假单胞菌的研制与应用

Biodegradation is an efficient way to eliminate the environmental estrogens pollution. But the identified microorganisms with estrogen degradation ability, because of their instable degradation capabilities and potential environmental threaten, are still difficult to be used into practical bioremediation and environment treatment. Therefore, it is urgent to construct the genetic engineered strain with stable estrogen degradation ability and safe environment effect. Based on the high-efficient estrogen degradation Pseudomonas strain SJTE-1 we separated from environment, this project will first use mutagenesis, transpon insertion mutation, and homologous recombination methods to generate the mutant strain, which can degrade estrogens more stably and efficiently. Then, the L-arabinose conditional-deadly system will be integrated into this strain to generate an environment-safe estrogen degrading strain whose survival is controlled by the nontoxic sugar. In different environmental conditions, its genetic stability, growth and decline situation, estrogen degradation capability and stability, conditional death efficiency and bio-safety will be measured. Finally, this strain will be put into the practical waste water treatment system to test the estrogen degradation result and environment effect. The success of this project will achieve the environment friendly bioremediation of estrogens, improve the treatment efficiency of estrogens pollution and enhance the quality of our living environment.

微生物降解是去除环境雌激素污染的有效途径。多数雌激素降解菌株，因不稳定的降解效率，潜在的环境威胁，尚不能直接释放来进行安全有效的环境修复与污染治理。因此，亟需构建可稳定高效降解雌激素且环境安全的工程菌株。基于我们已分离鉴定的雌激素高效降解假单胞菌SJTE-1，本项目拟通过诱变、转座子插入突变及同源重组替换雌激素降解关键基因启动子的方法，提升并优化菌株在不同环境中的雌激素降解效能与降解稳定性，构建可稳定高效降解雌激素的重组菌株。之后，整合已有的L-阿拉伯糖条件致死系统，构建可被无毒害糖类物质诱导致死的环境安全的雌激素降解菌株；测定其不同环境条件下的生长代谢与迁移消长状态、雌激素降解效能与稳定性、L-阿拉伯糖致死效果及生物安全性等。最终，将该菌株应用于污水处理小试系统，测定雌激素降解效果、生态影响与环境安全性。本研究的成功将实现环境友好的雌激素高效生物修复，提高实际应用中的雌激素污染处理效果。

微生物降解与修复是治理环境雌激素污染的有效途径。研制安全高效稳定的雌激素降解工程菌株是改进微生物处理雌激素效能，实现环境安全的环境修复的关键。本项目主要研究内容是遗传改造强化雌激素降解菌株SJTE-1的降解功能，优化其降解稳定性与环境适应性，构建环境安全的高效雌激素修复菌株。主要进展包括：1. 首次解析了假单胞菌降解雌激素的整体代谢网络与相关通路，证实了细菌会全面特异提高的相关代谢通路蛋白的表达水平和重要的能量代谢水平来适应胁迫环境。2. 确定了假单胞菌SJTE-1胞内存在完整的有多个酶参与的雌二醇途径；多个同工酶催化了第一步关键反应，可在不同条件下转录表达和发挥功能；鉴定了两个短链脱氢酶是该菌株转化雌二醇首步反应的主要酶和关键酶。鉴定了调控雌二醇降解的转录因子，确定多个不同家族的转录因子参与，多种多重调控模式并存。3. 改造强化了雌激素降解关键基因的转录水平，构建了高效稳定降解雌激素的工程菌株SJTE-1S。实验室条件和模拟环境土壤条件测试显示该菌株环境适应性好，雌激素降解效能稳定，降解周期缩短。在模拟的野外土壤环境中可迅速有效定殖，生长代谢正常。降解效能较稳定。4. 通过整合条件诱导致死系统，构建了阿拉伯糖诱导致死的高效稳定降解雌激素的工程菌株SJTE-1SC。该工程菌株的生长代谢与雌激素降解正常，对L-阿拉伯糖敏感，低浓度L-阿拉伯糖短时间即可有效诱导其死亡。在不同的模拟环境中，工程菌株可正常生长并长期存在，雌激素降解稳定，L-阿拉伯糖可有效诱导工程菌株死亡。5. 成功应用菌株SJTE-1SC在污水处理小试系统中，其在环境中可稳定存在，成为相对优势菌株，对原有菌群结构有一定影响，但不影响菌群组成。L-阿拉伯糖的加入可消除工程菌株的生态影响。6. 分离鉴定了多株具有复合污染修复潜能的雌激素降解菌株，以其为主要功能菌群的雌激素降解复合菌剂正在研制。本项目达到了预期研究目标，可推进微生物降解雌激素机制研究，实现稳定高效与环境友好的生物修复。

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