微藻共栖细菌的抑藻作用及基于群体感应的调控机制

本课题为探讨海洋微藻共栖细菌的抑藻作用机制问题，研究了微藻共栖细菌的抑藻活性与其群体感应(QS)系统的关系。从61株海洋微藻中分离获得206株海洋细菌，利用生物传感器方法筛选出11株细菌具有基于AHLs的QS系统。通过GC-MS检测，它们都含有C8-HSL信号分子，部分含有C6-HSL和C14-HSL，其中9株细菌具有抑藻活性，分别对东海原甲藻、棕囊藻、海链藻和赤潮异湾藻具有不同程度的抑制作用。一株抑藻细菌PD-2因其对宿主（东海原甲藻）具有显著抑藻作用而作为目标藻株深入研究。利用TLC生物自显影技术，探明细菌PD-2至少能产生三种AHLs信号分子，除了C8-HSL，PD-2还含有C12-HSL。建立了基于四爿藻（Tetraselmis sp.）的抑藻化合物跟踪分离筛选模型，通过半制备型HPLC从抑藻细菌PD-2代谢产物中分离纯化出两个抑藻化合物（1）和（4），通过质谱、红外、元素及核磁共振分析，确定了化合物（1）分子式为C23H24BrN2SO5，化合物（4）分子式为C15H13BrO3。经检索，化合物（4）为一新的化合物。此外，对抑藻化合物（4）产生的密度依赖性进行了研究，发现该化合物的产生与细胞密度呈正相关，即证实了抑藻细菌PD-2的抑藻活性具有密度依赖性。通过对细菌PD-2的全基因组测序、基因注释等分析工作，从中找到了两对调控QS的luxR/I同源基因，将它们命名为zla R/I和zlb R/I，从基因水平证明了PD-2具有群体感应系统。课题组建立了利用同源重组方法进行基因敲除的所有技术体系，包括PD-2利福平突变株的筛选，质粒转导体系的建立和验证。同时成功设计了要敲除的目标基因zlb I上下游基因片段的引物，并通过两步PCR技术对上下游基因进行了连接，这些为下一步同源重组双交换敲除目标基因奠定了良好的工作基础，下一步将利用限制性内切酶将上下游连接基因插入到自杀质粒pNTPS138 Kan中，再通过结合方式将该质粒转导入PD-2进行双交换同源重组，以敲除zlb I 基因，考察PD-2突变株的抑藻活性，从而进一步阐明PD-2的溶藻机制与群体感应功能的相关性。