NK/NKT细胞在HBV感染肝细胞癌发生发展中的作用及其分子机制

It has been well known that HBV-associated liver chronic inflammation injury is an important element to hepatocellular cancer. Our published data have demonstrated that hepatic NK/NKT cells play critical roles in the susceptibility to acute/chronic hepatitis and liver fibrosis of HBV transgenic mice. On the basis of these findings, we will explore the roles and molecular mechanisms of NK/NKT cells in the maliganacy of HBV-infected hepatocytes in this study. Acute and chronic hepatitis induced by immunologic (Poly I:C, Con A) or chemical (CCl4, DEN) triggering will be estabished to furter induce hepatocellular cancer in HBV transgeinc mice. During this process, liver pathology and serum biochemical indexes will be observed to show the dynamics of HBV-infected hepatocyte malignant transformation.The roles of NK/NKT cells will be demonstrated using gene-deficency mice and by cell depletion/transfer experiments. Further,the cirical molecules in NK/NKT cells innate immune responses will be detected and analyzed, including cytokines, chemokines, innate immune receptor, cytotoxic receptor/molecules, and then their roles in maligancy of HBV-infected hepatocytes will be confirmed. These studies will reveal the important mechanisms of NK/NKT cells innate immune responses in the process of HBV-infected hepatocyte malignant transformantion and the progression of HBV-associated hepatocellular cancer.

HBV感染肝脏慢性炎症损伤是导致肝癌发生的重要因素，我们已有的研究表明肝脏NK/NKT细胞天然免疫应答是导致HBV感染肝脏易发生急慢性肝炎、肝纤维化的重要机制。故本研究拟在已有的研究基础上进一步探索肝脏NK/NKT细胞在HBV感染肝脏恶性肿瘤发生发展中的作用及其分子机制。通过免疫刺激剂Con A、PolyI:C或化学毒物CCl4、DEN诱导HBV转基因小鼠急慢性炎症过程，进而诱导肝细胞癌的发生，动态观察HBV感染肝脏的病理学变化及多种生化指标，寻找肝细胞恶性转化发生的动力学特征及关键时间节点。通过基因缺陷小鼠，细胞清除及转输等实验手段验证肝脏NK/NKT细胞在该过程中的关键作用，并进一步监测寻找NK/NKT细胞行驶天然免疫应答的关键分子（细胞因子、趋化因子、天然免疫识受体、杀伤受体/分子）及其与肝细胞恶变之间的关系，从而揭示NK/NKT在 HBV感染肝细胞癌变与肿瘤形成过程中的重要机制。

HBV感染肝脏慢性炎症损伤是导致肝癌发生的重要因素，而固有免疫应答在其中的作用尚不清楚。本研究旨在探索肝脏NK/NKT 细胞介导的肝脏炎性损伤在HBV感染肝脏恶性肿瘤发生发展中的作用及其分子机制。通过低剂量Poly I:C（3μg/g body weight）刺激4-5月龄HBs-Tg小鼠（C57BL/6J-TgN (AlblHBV) 44Bri）8周（2次/周），结果发现肝脏呈现慢性炎症状态，表现为血清ALT/AST水平的上升，肝脏炎性细胞的浸润及胶原沉积。刺激6个月后，100% HBs-Tg小鼠发生HCC；对照组12-13月龄HBs-Tg小鼠仅16.7%自发肿瘤，24-25月龄约40%自发肿瘤。生存期亦表明Poly I:C刺激后HBs-Tg小鼠死亡率显著上升。WT小鼠中，低剂量Poly I:C刺激不能诱导肝脏炎症的发生，亦不会形成肿瘤。HBs-Tg小鼠在Poly I:C（1st 以及16th ）刺激后肝细胞凋亡及增殖均显著增多；肝脏NK和NKT细胞比例、数量显著上升，高表达FasL, TRAIL, NKG2D, CD107a以及IFN-γ。利用PK136抗体清除HBs-Tg小鼠体内NK和NKT细胞，Poly I:C刺激后血清ALT显著降低，并伴随血清IFN-γ显著降低，6个月后小鼠不发生HCC。进一步利用HBs-Tg-IFN-γ-/-小鼠，Poly I:C刺激后其血清ALT显著低于HBs-Tg小鼠，且未见HCC的发生，证实NK和NKT细胞的作用依赖于IFN-γ。利用尾静脉高压注射Plive-IFN-γ质粒的方式，靶向肝脏表达IFN-γ可诱导HBs-Tg小鼠发生明显的肝脏炎性损伤，并在6个月之后全部发生HCC。另外，在已发生HCC的HBs-Tg小鼠中肝脏NK和NKT细胞表型发生显著变化，低表达NKG2D、Trail；高表达NKG2A、TIGIT；IL-10分泌水平显著上调。同时研究发现在TLR2-/-小鼠中IL-18诱导MDSC细胞的聚集进而抑制T细胞的抗肿瘤功能是导致DEN诱导肿瘤更为严重的关键机制。在慢性乙型肝炎患者中CD3brightCD56+ T细胞的出现是导致肝脏慢性炎症发生发展的重要原因。该课题研究揭示了固有免疫应答诱导的肝脏慢性炎症在HBV感染肝脏HCC发生发展中的重要作用及其分子机制，为HBV感染性疾病的防治提供重要的理论依据。

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