根据生长信号分子复合物鉴定食管癌证候诊断/治疗新靶标

本项目以食管癌病人血清和手术切除标本为研究对象，建立生长信号分子复合物（GSMC）分析技术，通过生长信号分子复合物的分离和蛋白组学分析,从食管上皮、正常增生、癌组织和食管癌各中医证候癌组织中鉴定出食管癌变阶段和证特异性信号蛋白质分子，查明该分子与信号蛋白质的相互作用，进而用样品分离-活性测定-质谱分析的集成技术鉴定出血清生长活性肽，以期揭示食管癌多阶段癌变和证候发生生长信号转导机理和血液内环境影响食管癌癌变的分子机理，发现食管癌癌变阶段和证特异性分子或表达谱，提供食管癌诊断/治疗新靶标，创立中医证候功能蛋白质组学研究新范例。

本项目以食管癌病人血清和组织标本为研究对象，通过磷脂酶信号分子多重复合物的分离和蛋白组学分析,从食管癌各证候癌组织、血清中鉴定出71种证相关蛋白质分子，其中血清差异蛋白14种、组织57种，共有30种蛋白质首次在食管癌组织和血清中发现，进而对食管癌磷脂酶信号分子复合物进行分离和分析，发现各证候食管癌细胞胞膜窖PLC-γ1与窖蛋白-1、PKCα有不同程度的结合，并首次发现97kD酪氨酸磷酸化蛋白。用基因芯片技术发现痰气交阻证、瘀血内结证、津亏热结证和气虚阳微证在食管癌不同阶段（癌组织、癌旁组织、正常组织）差异表达基因5164个，主要涉及催化活性、信号转导、分子转运、结合、酶活性调节、转录活性调节、蛋白运输功能、细胞生长、凋亡等功能过程。进而检测各证候组织和血清中的分泌蛋白，发现CTHRC1和PLAU在痰气交阻证中、PLAUR在气虚阳微证中、PCSK9和IL-8在津亏热结证中、TNFRSF11B在瘀血内结证中、MMP1和MMP11在四个证型组中显著升高。食管癌证方的不同乙醇洗脱物能明显抑制食管癌EC9706细胞中上述蛋白中CTHRC1、IL-8、TNFRSF11B、MMP1、MMP11的表达。对不同证候食管癌血清进行肽质谱分析，与正常组比较，瘀血内结组检测出36个差异表达蛋白峰，津亏热结组检测出41个差异表达蛋白峰，气虚阳微组检测出51个差异表达蛋白峰，痰气交阻组检测出40个差异表达蛋白峰。用新样本进行盲法验证，各证候组特异性为80%~90%，准确性为88.5%~92.3%。对检测出的蛋白峰进行MASCOT搜库发现CMPK2肽在四证型中表达增加2.11-2.96倍。用200ng/ml CMPK2明显刺激食管癌EC9706细胞增殖和CTHRC1、IL-8、TNFRSF11B、MMP1、MMP11蛋白表达，食管癌证方对其有明显抑制作用。并研究了食管癌证方诱导食管癌EC9706细胞周期阻滞的信号转导及调节hEGF刺激的细胞生长信号转导机制，以及食管癌的证候分布和从肝论治食管癌的理论溯源及辨证论治体系的构建。本研究为进一步研究食管癌的癌变机理、中医证候分子病机和诊断治疗靶标及方药作用分子机理提供了基础，为中医证候功能蛋白质组学研究创立新范例。

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