温度介导RNA二级结构的改变对恶性疟原虫发育的调节作用和机制研究

The developmental stages of Plasmodium spp requires strictly process control, and the change of living temperature can trigger malaria parasite’s developmental switch from asexual replication to sexual differentiation and affect the transmission of malaria. We found that the specific RNA secondary structures play a key role in the A-type to S-type transformation and significant difference in expression of ribosomal RNA, which play a leading role in the response of living temperature. Combined analysis of RNA-seq and icSHAPE (in vivo click selective 2-hydroxyl acylation and profiling experiment) results, we found that the differential expression of 22 temperature-sensitive genes was caused by the change of RNA secondary structure. It is confirmed that Plasmodium can cope with temperature changes by altering its RNA secondary structure, but how the specific RNA secondary structure and its RNA binding protein regulate gene expression remains unsolved. Here we propose to study the role and mechanism of the specific RNA secondary structure using E.coli galactosidase activity experiment in vitro and the synonymous codon gene editing in malaria parasites, and then to identify RNA binding proteins in the structural region through the capture of the newly transcribed RNA interactome using click chemistry (RICK) and electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The result from this study will provide important implications for understanding of host-parasite interaction and the development of efficient vaccine or drugs.

疟原虫的发育过程受到严格的时期调控，其中由环境温度介导的基因调控是其从无性裂殖到有性发育转变和疟疾传播的关键。我们前期研究发现，疟原虫应对环境温度变化的过程中，具主导作用的核糖体RNA类型的转变和表达会通过其自身形成不同的二级结构而起作用；转录组数据和icSHAPE转录组RNA二级结构分析结果显示，有22个温度敏感型基因表达的差异是由于其mRNA二级结构的改变而引起的。表明疟原虫会通过改变自身mRNA二级结构来应对温度的变化，但疟原虫特定的RNA结构及其结合蛋白是如何调节基因转录的尚待研究。本项目拟通过体外大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性实验和体内同义密码子基因编辑实验来判断特定二级结构的形成对基因转录水平的影响、以及通过RICK和凝胶迁移实验鉴定在结构区域的RNA结合蛋白，以发现特定二级结构在基因调控过程中的作用机制，从而为设计疟原虫传播阻断策略和药物研发提供新的靶点和思路。

项目通过icSHAPE测定了恶性疟原虫全转录组RNA二级结构，获得了红内期环状体阶段和晚期大滋养体阶段至少3396个转录本的体内体外RNA二级结构。通过对不同时期以及体内体外RNA结构进行比较分析，确定了疟原虫发育过程中的一些关键调控区域和特征。通过对两种温度条件下，疟原虫体外和体内转录组icSHAPE二级结构数据，分析了环状体和滋养体阶段疟原虫在单核苷酸分辨率下随温度变化的RNA二级结构变化情况，证实了低温会影响18S小亚基核糖体RNA和有性发育阶段特异基因的RNA二级结构。并且发现，当温度从37℃下降到26℃时，滋养体阶段基因RNA二级结构的改变程度显著大于环状体阶段。将不同环境条件下RNA二级结构的改变与基因表达情况的变化相结合，来比较环境改变所引起的RNA二级结构的改变对疟原虫生长发育的影响。证实RNA二级结构的复杂程度与基因的表达水平存在一定负相关性，同时发现了几种存在于恶性疟原虫中的对温度快速响应的RNA温度调节器。.对低温诱导后表达情况发生变化的基因，进行二级结构变化区域的序列特征查找，发现了诸多显著性的序列基序位点，其中包括某些RNA结合蛋白。与特定RNA二级结构所结合的RNA结合蛋白的相关研究，可为后续探讨不同二级结构下结合的RNA结合蛋白在疟原虫不同发育时期的装配机制提供数据支持。目前，我们还不清楚这些RNA结合蛋白在低温诱导恶性疟原虫的发育过程中起什么作用，正着手进行此方面的功能性研究。后续研究的开展可丰富RNA二级结构存在于疟原虫研究领域的一种新的表观遗传调控机制，为阻断疟原虫传播、抑制宿主体内复发的药物研发和疫苗设计提供数据支持。

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