阻断炭疽毒素致病作用的人源寡克隆抗体组合的筛选与评价

制备具有生物学活性的炭疽保护性抗原PA和致死因子LF是本研究的基础。参照PA和LF基因序列设计引物，采用高保真扩增目的基因ORF，将其克隆于表达载体pPAsig上，阳性克隆质粒经SCS110转化后，电击入BH336炭疽杆菌中，培养工程菌并收集上清液，采用阴离子交换柱进行蛋白纯化，最后利用凝胶过滤层析，获得纯度较高的目的蛋白。. 通过扩增人源抗体可变区基因，合成Fab基因，构建Fab噬菌体抗体库；采用不同的筛选方法，获得多株人源抗PA抗体Fab分子。以人源抗PA抗体Fab为模板，扩增抗体的可变区基因，克隆于IgG真核表达载体中，转化293F细胞，表达并纯化抗PA抗体IgG分子；筛选具有高中和活性的抗PA鼠源单抗，扩增抗体的重链可变区和轻链可变区基因，克隆与IgG分子的真核表达载体中，转化293F细胞，表达并纯化抗PA的嵌合抗体。ELISA、IP和质谱分析结果显示，PA21和mhPA63抗体能够与PA83特异性结合；用Biacore-X100检测PA21和mhPA63与PA83的亲和力，结果显示，PA21抗体的Kd值为1.0003×10-9M，mhPA63抗体的Kd值为 1.438 × 10-10 M。. 用J774A.1细胞进行体外中和活性检测，结果显示，二株抗体具有较好的中和活性，抗PA21和mhPA6单抗的中和活性在LF10μg/ml的浓度下，细胞保护率分别达98%和95%。. 通过中和抗体体内保护性实验的预实验发现，wistar大鼠、Balb/c小鼠和裸鼠对炭疽毒素不敏感；当选用F344大鼠时，该鼠对炭疽毒素具有较好的敏感性。将抗体mPA6与毒素同时注射，当抗体剂量达到45μg/只时，抗体对大鼠保护率为100%；先注射抗体，5min后注射致死剂量的毒素，当抗体mPA6剂量达到45μg/只，抗体对大鼠保护率为100%；在注射致死剂量毒素前96h注射45μg/只抗体mPA6，抗体对大鼠保护率为100%。. 将抗体PA21与毒素同时注射，当抗体剂量达到10μg/只（0.067mg/kg）时，抗体对大鼠的保护率为100%；先注射致死剂量的毒素，5min后注射抗体，当抗体PA21剂量达到20μg/只（0.133mg/kg），抗体对大鼠保护率为100%；在毒素注射前24h注射PA21抗体20μg/只，抗体对大鼠保护率为100%。