Cdk2ap1和Smarce1基因在鸡胚性腺发育中的功能研究

为推动鸡性腺发育相关基因功能研究的深入，本研究选择SMARCE1和 CDK2AP1两个基因，以及根据最新研究进展增加的FOXL2基因，利用逆转录病毒介导的RNAi和超表达技术研究这三个基因在鸡胚性腺发育中的作用。研究结果：1.成功构建了SMARCE1基因的重组逆转录病毒超表达载体和逆转录病毒RNAi表达载体，并获得高滴度的病毒颗粒，筛选出干涉效果最好的RNAi载体；Q-PCR及免疫荧光结果显示，在细胞中SMARCE1的超表达引起了SOX9、CYP19A1的表达及AR和ERα的上调表达；Q-PCR、WISH及免疫组化结果显示，在鸡胚中SMARCE1的超表达引起了CYP19A1在雄性中、SOX9在雌性中的表达，使AR的表达下调，ERα的表达上调；HE 染色结果显示，SMARCE1 超表达后鸡胚性腺在E12.5时卵巢皮质明显增厚，睾丸曲细精管增多，间质细胞增加；在细胞中干涉SMARCE1后SOX9、AR 及 ERα的表达均下调，但在鸡胚中干涉SMARCE1后引起鸡胚的大量死亡。2.成功构建CDK2AP1基因的重组逆转录病毒超表达载体和逆转录病毒RNAi表达载体，获得高滴度的病毒颗粒，并筛选出干涉效果最好的RNAi载体；Q-PCR及WB结果显示，在细胞中CDK2AP1 能显著上调 AR和 FOXO3a的表达，下调ERα及CDK2的表达；流式细胞仪检测结果显示，CDK2AP1超表达后，G1期细胞比例显著上升，S 期和 G2/M 期细胞比例显著下调；而在干涉CDK2AP1后，G1 期细胞比例显著下降，S 期细胞比例无变化，G2/M 期细胞比例显著上升。3.成功构建FOXL2基因的重组逆转录病毒超表达载体和逆转录病毒RNAi表达载体，获得高滴度的病毒颗粒，并筛选出干涉效果最好的RNAi载体；在细胞中超表达FOXL2后，WNT4、CYP19A1、ER的表达下调，AR的表达上调；干涉FOXL2后，AR表达无显著变化，WNT4、CYP19A1呈上调表达，ER呈下调表达。以上结果表明，SMARCE1通过调控ERα和AR的表达促进鸡胚性腺的发育；CDK2AP1通过调控 FOXO3a 和 CDK2 参与机体细胞增殖、细胞凋亡等途径而对胚胎和性腺发育起作用；FOXL2对于卵巢发育相关基因均有一定的调控作用。这些鸡胚性腺发育候选基因的功能验证，为进一步完善鸡胚性腺发育基因调控网络提供了重要线索。