三种不同病因肌萎缩侧索硬化症基因修饰大鼠模型建立与对比分析

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease of motor neurons that causes progressive weakness and death and the prevalence rate is about 6/100,000. There is no effective therapeutics available for ALS so far. The limited gene modified animal models could copy only 10% of the pathological mechanisms of ALS. Recently, the most common causal gene of ALS was indicated that the C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion (HRE) leads to 7% sporadic cases and 40% of and familial cases in western and leads to 2% sporadic cases 18 % of familial cases in Chinese. The ephrin receptor epha4 (EPHA4) was one of the most common modifier genes, and inhibition of its expression could prevent the degeneration of motor neurons. Both of them were the targets for drug discovery and involved in ALS pathological mechanisms of RNA-processing abnormalities, ER dysfunction and ER stress and the receptor stress. Unfortunately, the applicable ALS mammalian models for the two important genes have not been established. In this current proposal, the HRE knockin rats, EPHA4 transgenic rats, C9orf72-GFP knockin rats and the EPHA4-Luciferase knockin rats will be produced with the CRISPR/cas9 system, which has been running effectively in our genetic engineering platform. Furthermore, the 4 lines of the gene modified rats will be comparatively analyzed on the development of neurodegeneration, muscular atrophy, and movement defect. The mechanism of cytotoxicity of HRE and the function of C9orf72 will be also elucidated by comparison of the HRE knockin rats and the C9orf72-GFP rats. Additionally, the effect of EPHA4 over-expression or deletion on ALS development will be explored using the EPHA4 transgenic rats and EPHA4-Luciferase rats. Most importantly, the ALS rat models and gene labeling rat models will be supplied for ALS research and drug discovery.

肌萎缩侧索硬化症是一种累进性运动神经元选择性退化为特征的疾病，患病率约为6/10万，无有效的治疗方法。现有的几种模型只能反映10%的发病机制。最近发现C9orf72 HRE序列导致的散发性和家族型病例分别为7%和40%，汉人比例分别为2%和18%，是最普遍的致病基因。EPHA4低表达可以保护运动神经元凋亡，是目前确定的主要的ALS的修饰基因。二者分别代表了RNA加工、内质网、细胞膜受体三种发病机制，但是尚未建立相应的哺乳类动物模型。本题拟利用我们成熟的CRISPR/cas9大鼠基因修饰平台， 建立HRE序列敲入和EPHA4转基因大鼠、C9ofr72绿色荧光基因标记和EPHA4荧光素酶基因标记大鼠。并对比分析几种基因修饰大鼠的神经退化、肌肉萎缩等病理进程，阐明HER序列、C9ofr72和EPHA4表达水平在ALS发病中的作用。为ALS的医药研究提供多病因动物模型和药物研发用的靶基因标记模型。

近年发现的C9orf72第一外显子区的GGGGCC重复序列增多（HRE序列）是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和颞叶痴呆（FTD）的最普遍的致病因子。一、国际上建立的C9orf72 HRE序列转基因小鼠大部分没有ALS表型或不能反应HRE序列的全部致病机制；二、C9orf72蛋白是否参与ALS的发病过程目前还在争论之中；三、EphA4是促进ALS病理进程的主要修饰基因，而目前没有一个EphA4基因报告模型。基于以上三个科学问题，我们利用大鼠基因编辑技术，分别建立了C9orf72敲除大鼠（C9orf72-Ko），HRE序列敲入大鼠（C9orf72-（G4C2）80 repeats-KI)，C9orf72-eGFP报告大鼠（C9orf72-eGFP-KI）和EphA4-mCherry报告大鼠（EphaA4-mCherry-KI）。并对比分析几种基因修饰大鼠病理情况，结果表明： .（1） C9orf72敲除大鼠在岩藻酸存在的情况下，发生渐进性ALS，证明C9orf72蛋白本身也参与ALS的发生，而且是与兴奋毒性相互作用的重要基因。这一发现一方面补充了C9orf72对ALS的致病机制，C9orf72基因敲除大鼠也成为研究ALS遗传与环境因素相互作用的模型。.（2）C9orf72-（G4C2）80 repeats-KI大鼠表现渐进性运动神经元丢失，运动缺陷和后肢瘫痪等严重的ALS表型。该模型是世界首例反应HRE序列毒性和C9orf72蛋白丢失双机制的ALS模型，可用于ALS和FTD的机制研究。.（3）Wnt通路失调是参与PD，AD和ALS等进程的重要因素，我们发现在神经退行性变发病过程中，Wnt通路失调与DKK3的低表达有关，转基因表达DKK3，激活Wnt非经典通路的PKC和抑制经典通路的GSK3，抑制TAU磷酸化和促进ADAM10对a-beta的降解作用，从而抑制神经退行性变的病理进程。

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