具有可调控TNF-α与IL-1介导的信号通路的新型苯并噁唑酮抗炎小分子化合物库的构建及其作用机制研究

The research on new anti-inflammatory drugs with new mechanism of action and new target is of great significance. A series of 4-substituted benzoxazolone derivatives with determined anti-inflammatory activity was synthesized in our research group. The preliminary study presented that the regulation of TNF-αand IL-1 mediated signaling pathways might be the crucial anti-inflammatory mechanism of these compounds, but the specific pathways and target were unclear. Therefore, a new series of benzoxazolone derivatives will be synthesized on the basis of the lead compound 4-o-methyl-benzenesulfonyl benzoxazolone (MBB) to gain high anti-inflammatory agent as the small-molecule probe. Then, the inflammatory factors TNF-a and IL-1 mediated inflammatory mechanism will be discussed to elaborate whether these signal pathways played important roles in the anti-inflammatory activity of these compounds. Afterwards, the proteomic technology is used to illuminate the activity mechanism systematacially. Finally, the target of the compounds will be discussed using cell thermal analysis technology combined with the analyzing of the altered proteins and computer aided design software. The results will provide scientific basis for the further structural optimization of this kind of compounds, and provide new thoughts for the design of novel anti-inflammatory drugs with new mechanism and target.

新机制新靶点新型抗炎药物的研究具有重大的意义。课题组前期通过系统合成筛选获得了多个具有明确抗炎活性的4-取代-苯并噁唑酮衍生物，初步研究提示该类活性化合物可能是通过调控炎症重要因子TNF-α与IL-1介导的信号通路来发挥抗炎作用的，但具体机制和作用靶点尚不清楚。为此，拟以前期获得的具有显著抗炎活性的化合物4-邻甲基苯磺酰氧基苯并噁唑酮（MBB）为先导化合物，合成构建新型苯并噁唑酮小分子库，以获得具有更高抗炎活性的新结构化合物，以其作为小分子探针，综合应用分子生物学技术研究其调控炎症重要因子TNF-α与IL-1介导的信号通路的具体途径，进一步运用蛋白质组学技术系统的探讨其抗炎机制；通过分析差异蛋白，并结合计算机辅助设计软件与细胞热转变分析技术，寻找作用靶点。本研究结果将为该类化合物进一步结构优化提供科学依据，也为新机制新靶点抗炎药物的设计提供理论依据。

基于炎症在疾病发生发展中的重要作用，及其现有抗炎药物临床使用中的问题，开发新靶点新机制的新型抗炎药物具有重要的研究价值。本课题在已有研究基础上，继续以苯并噁唑酮为母体结构，开展化合物的设计合成与抗炎活性筛选工作。共计合成四类100余个4-取代苯并噁唑酮衍生物，并通过ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR对其进行了结构确证。化合物体外抗炎活性测定结果表明该类化合物可抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7 NO和炎症因子的释放，构效关系分析表明4位和N位双取代活性较高；其中化合物1r对IL-6的IC50值为8.61μΜ，5l对IL-1β的IC50值为1.93μΜ，2j对iNOS的IC50值为3.342μΜ；同时，化合物1r和2j在二甲苯致小鼠耳肿胀动物模型中同样表现出显著的抑制作用，口服给药25mg/kg时，其抑制率达66.28%和66.67%，较阳性药塞来昔布（42.08%）有显著性提高。为了进一步明确化合物的临床应用方向与潜力，我们构建了LPS诱导的小鼠急性肺炎模型，口服给予化合物1r和2j，实验表明化合物1r和2j可剂量依赖性的降低LPS引起的小鼠急性肺炎血清炎症相关因子TNF-α，IL-1β，IL-6和iNOS的表达，可显著改变粒细胞浸润，减少肺组织出血，减少血管损伤，平滑肌细胞胞核固缩等损伤，尤其在高剂量（12.5mg/kg）组，各项炎症相关因子指标与正常组无显著性差异，呈现出较好的临床应用潜力。转录组学与分子作用机制研究表明化合物对TLR4/MD2介导的NF-κB 信号通路以及p-38/ERK介导的MAPK信号通路具有显著的调控作用，且可干扰LPS与细胞表面受体的结合，具有与TAK242（TLR4的阻断剂）的协同作用，为新型TLR4/MD2抑制剂。本项目研究结果证明化合物4-取代苯并噁唑酮类化合物具有明确的抗炎活性，TLR4/MD2为其潜在的作用靶点，且化合物1r和2j在治疗急性肺炎中具有较好的临床应用潜力，为新型抗炎药物的研究提供了作用靶点与化合物结构优化的理论依据。

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