用“基因组编辑 ”工具－ZFN研究白血病DNMT3A突变的分子机制

DNMT3A mutation, as an independent risk factor strongly forecast the recurrence, is a fresh somatic cell acquired mutations found in acute myeloid leukemia (AML). The mutation gathers in the normal karyotype/acute myeloid leukemia (CN-AML), and the point mutation of arginine locating in 882 is the most common form. Because the specific molecular mechanism of the worse prognosis of leukemia is still not clear, different areas of large sample of acute myeloid leukemia retrospective studies reported various results in the gene expression profiles, methylation level and model by comparing the positive to the negative in DNMT3A mutation. The fundamental reason may origin from the genetic background and individual difference. From this point, we apply zinc finger nucleic acid enzyme technology to construct a vitro model with DNMT3A882 mutation, which base on a kind of cell line. Later, we intend to select cell clone with the DNMT3A mutations, and analyse the information from profiling chip and whole genome methylation chip. Then, looking for the related downstream controlling gene by in vivo and in vitro experiments, so as to recognize the special target related to DNMT3A mutations in the AML prognosis,and provide the new theoretical foundation to accurate stratification diagnosis and targeted therapy for AML.

DNMT3A突变，是一种在急性髓系白血病（AML）中新发现的体细胞获得性突变，作为强烈提示白血病复发的独立危险因素，主要聚集在中危/正常核型急性髓系白血病（CN-AML）中，而882精氨酸位点点突变是最常见的突变形式。鉴于其使白血病预后更差的具体分子机制尚不明晰，不同区域协作组进行了大样本急性髓系白血病的回顾性研究，结果表明DNMT3A突变阳性组与DNMT3A突变阴性组基因表达谱数据不尽相同，甲基化水平和模式不一，其根本原因可能归结于遗传背景及个体差异。因此，本项目用锌指核酸酶技术人工构建了DNMT3A882突变的细胞模型，拟运用表达谱芯片及全基因组甲基化芯片筛选DNMT3A突变模型中异常表达的基因，通过体内和体外实验寻找DNMT3A突变下游相关调控靶点，从而识别因DNMT3A突变导致AML较差预后的关键靶标，进而为准确进行AML分层诊断、DNMT3A的临床干预及靶向治疗提供新的理论基础。

DNMT3A突变是成人白血病患者中常见突变基因，发生率占据总发病人数的18~23%，其中62%-67.8% 的DNMT3A突变患者属于白血病FAB分型中的M4/M5 型，其中，DNMT3A R882位点是DNMT3A最为常见的突变位点之一。DNMT3A突变目前被认为是成人de novo AML患者的不良预后因素之一，然而，这一突变导致AML预后不良的具体机制尚不明确。本研究力图通过建立DNMT3A突变的细胞模型，研究DNMT3A突变对于AML疾病发生及进展的影响及其具体分子机制。. 本项目通过利用TALEN基因组编辑技术建立了携带有DNMT3A R882突变的细胞系，我们发现携带有突变DNMT3A基因的细胞系具有显著增强的细胞增殖能力。利用微阵列分析发现，DNMT3A突变的细胞系中参与谷胱甘肽合成的相关基因，包括CTH，PSPH，PSAT1以及半胱氨酸/谷氨酸转运体SLC7A11的表达量显著升高，并最终导致细胞内谷胱甘肽的含量上升。后续功能实验证实，携带DNMT3A R882突变的克隆具有显著显著增强的化疗药物耐药性以及更强的细胞存活能力。此外，本项目同时比较了携带DNMT3A R882突变及DNMT3A野生型的AML患者的初诊流式细胞学数据，发现DNMT3A R882突变AML患者相比于DNMT3A野生型AML患者的恶性克隆免疫表型具有显著增高的CD11c/CD14，干细胞标志CD34，髓系细胞表面标志cMPO显著降低；通过公共数据库进行微阵列数据生物信息学分析研究DNMT3A R882突变对AML恶性克隆的表达谱影响，发现DNMT3A R882突变患者表达谱中单核细胞分化基因MAFB显著高于DNMT3A 野生型患者。进一步研究发现，携带DNMT3A R882突变的AML患中，MAFB高表达者相比于低表达者具有更好的临床预后。. 本项目研究成果提示，DNMT3A R882突变在AML的发生中扮演重要角色，其影响恶性克隆细胞内GSH合成路径的新机制可作为未来治疗AML的新方向。此外，DNMT3A R882突变可通过影响恶性克隆的免疫学表型影响患者预后，这为今后进一步对DNMT3A突变的AML患者预后进行分层提供新的依据。

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