猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组RNA衣壳化机制的研究

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus（PRRSV） genomic RNA encapsidation is a key step for virus assembly. This process involves the interaction between the RNA binding domain of N protein and RNA packaging signal locating in genomic RNA. Currently, the RNA packaging signal remains largely undescribed and little is known about the key motif or key amino acids or motif in RNA binding domain interacting with RNA packaging signal. In this proposal, to more precisely define the location of the PRRSV packaging signal within the genomic RNA and identify the motif or key amino acids of N protein interactive with genomic RNA sub-genomic RNA, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), Northwestern blotting and genetic manipulation are performed to analyze the interaction between N protein and virus genomic RNA. Reverse genetic manipulation on RNA- binding region and packaging signal is carried out to analyze the virological and molecular biological characteristics of the mutated viruses. The finding of his study will lay a theoretical foundation for understanding the mechanism of PRRSV genomic RNA encapsidation and exploration of the potential antiviral targets.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组RNA衣壳化（encapsidation）是病毒组装过程中的关键步骤。这一过程涉及N蛋白RNA结合区（RNA-binding domain）与病毒基因组RNA包装信号（packaging signal）的相互作用。目前，PRRSV基因组RNA衣壳化的机制尚未清楚。本项目中，我们拟通过Northwestern blotting、电泳迁移率实验（EMSA）和基因操作等方法来鉴定病毒基因组RNA中的包装信号和N蛋白RNA结合区中的关键氨基酸，并进一步解析包装信号中与N蛋白相互作用的结构和功能位点。在此基础上，对N蛋白RNA结合区和基因组RNA包装信号进行反向遗传操作，拯救突变病毒。分析突变病毒的病毒学和分子生物学特性，研究病毒基因组RNA衣壳化在病毒复制过程中的作用。本项目为深入了解病毒基因组RNA衣壳化机制以及为发现潜在的抗病毒靶标奠定理论基础。

本项目中，我们构建了PRRSV广西分离株GXNN1396的细胞传代致弱毒株PRRSV感染性克隆（pGXAM）。在nsp2高变区，ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5a之间插入了RFP和GFP基因，获得了能够表达外源基因的重组PRRSV。以构建的PRRSV反向遗传操作系统为基础，构建 PRRSV ORF7起始密码子突变质粒以及在N蛋白最N端、最C端和中间缺失6个氨基酸的突变克隆，同时，构建表达PRRSV N蛋白的MARC-145细胞系，将PRRSV ORF7起始密码子等突变质粒转染MARC-145细胞和MARC-145-N细胞系，通过传代、细胞病变、RT-PCR和IFA试验发现，PRRSV ORF7起始密码子突变质粒不能在MARC-145细胞上产生感染性的病毒粒子，但转染MARC-145-N细胞系能够拯救出病毒，表明PRRSV N蛋白缺失及部分缺失质粒不能在表达N蛋白的系统系拯救出病毒。提示N蛋白编码序列可能存在顺式作用原件，进而影响病毒拯救。通过重叠PCR方法，分别将EAV和LDV的N蛋白编码区或其RNA结合区（RBD）、C端二聚体区（CDD）替换PRRSV N蛋白的相应区域。构建了6个以PRRSV为骨架的动脉炎病毒N蛋白嵌合克隆。将这些嵌合克隆转染MARC-145细胞，通过传代、细胞病变、RT-PCR和IFA试验发现，在这些嵌合克隆中，只有C端二聚体区（CDD）嵌合能够拯救出病毒，说明LDV N蛋白C端二聚体区（CDD）能够功能替换PRRSV N蛋白的CDD。LDV N蛋白RNA结合区替换 PRRSV N蛋白的RNA结合区的嵌合克隆是致死性的，通过对两者的RNA结合区序列比对发现LDV N蛋白的RBD的Q44、K44和Q48位点氨基酸与PRRSV N蛋白相应位置不同，说明这几个氨基酸的替换可能会影响病毒与RNA信号的包装，从而影响病毒的复制。

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