微流控体系下DNA-蛋白质相互作用的单分子检测技术研究

该研究目标是利用微流控技术和全内反射荧光显微技术相结合，发展可用于细胞内蛋白复合物的相互作用、高通量、可视化的单分子检测新方法。与传统生物化学测量不同，单分子检测可反映出单个蛋白分子的结构变化和动力学。研究首先拟发展微流控PDMS表面改性技术和激光共聚焦荧光显微法，系统研究荧光蛋白分子在微流控表面的吸附和固定效果。其次，通过微流控层流技术控制蛋白复合物分子在微芯片表面的浓度、结构和扩散系数等参数。最后，我们将这种微流控-单分子检测技术应用于1）研究二种亲和力强弱不同的适配子(15-和32-碱基对)，与凝血酶相互作用的可视化及动力学差异，为解决瞬态、弱的蛋白相互作用研究提供一种可行的方法；2）在微反应室中固定Her2乳腺癌细胞，将蓖麻毒素A链蛋白与碳纳米管结合，观察细胞表面的吞噬作用和细胞内的代谢过程。这种微流控-单分子检测技术在药物靶向筛选、蛋白质相互作用等许多领域都有很好的应用。

活细胞内DNA与蛋白相互作用一直是化学及生物科学家研究的热点。但是，即使是高通量的蛋白组学方法也难以解决低丰度、低浓度的蛋白质及其弱相互作用的检测，假阳性和假阴性问题普遍存在。该项目的研究目标是利用微流控和激光共聚焦荧光显微等技术相结合，发展可用于细胞蛋白质与DNA的相互作用、高通量、可视化的单分子检测新方法。我们的研究内容包括：1）建立了一种新型的微流控荧光分析平台，可用于肿瘤细胞的高通量和可视化检测，为活细胞内的蛋白质功能研究提供了一种可靠的技术。这种33通道的PDMS微流控芯片的检测原理基于氧化石墨烯与荧光核酸适体之间发生了荧光共振能量转移效应，利用核酸适配体Sgc8能与CCRF-CEM细胞表面过表达的酪氨酸激酶（PTK7）发生专一作用，从而诱导FAM-Sgc8c/GO复合物的荧光信号恢复来定量检测通道中肿瘤细胞的浓度，其检测限达到了单细胞水平，有望应用于肿瘤细胞水平早期筛查和诊断。2）建立了活细胞原位荧光成像的新方法，可用于肿瘤活细胞膜表面膜蛋白和细胞核内蛋白质的可视化检测。研究采用激光共聚焦荧光显微技术，发展了石墨烯-荧光单标记适配体复合探针、纳米石墨烯-荧光单标记多肽复合探针、苯硼酸标记的纳米荧光硅球复合探针等，实现了对多个和单个活细胞中膜蛋白、核蛋白和糖基化官能团等多目标、多层次地活体荧光成像分析，可用于肿瘤的早期诊断和治疗研究。3）建立了多种高灵敏、非标记的光/电化学分析新方法，可检测微量的目标细胞和蛋白质。如基于适配体构象变换和循环酶切放大原理，发展了一种高灵敏、简便、可视化检测肿瘤细胞的比色新方法，检测限达到了48个细胞。该方法简单、灵敏，非常适合于肿瘤细胞的早期诊断和筛选。发展了一种基于纳米Fe3O4颗粒-核酸适配体的非标记电化学分析方法，电极表面凝血酶与核酸适体相互作用产生的构象变化，用高灵敏的示差脉冲伏安法检测，检测限可达100 pM的凝血酶，具有很好的临床应用价值。总的来看，我们在微流控芯片与荧光显微检测接口技术、弱信号放大和可视化技术、活体荧光标记技术、非标记的纳米传感技术方面形成了自己的特色，可应用于活细胞荧光成像、肿瘤早期筛查、诊断和治疗等众多领域。

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