维生素B12输入体蛋白BtuCD的构象变化和转运机理研究

ATP-binding cassette(ABC)transporters actively translocate substances across cell membranes, involving in many important biological processes.They are also implicated in multidrug resistences in bacteria infection and cancer therapy. Vitamin B12 transporter BtuCD is a typical model system in the study of molecular mechanism of ABC transporters. This project aims to study the thermodynamics and kinetics of conformational movement of BtuCD at atomic level using molecular simulation methods. We will calculate the free energy profiles of conformational transition among the four conformations of BtuCD using enhanced sampling methods such as adaptive biasing force and metadynamics, obtaining the overall picture of conformational movement during translocation cycle of BtuCD. In order to elucidate the regulation roles of BtuF and nucleotides to BtuCD conformational transition, we will calculate the free energy change upon their association to the transporter. We will calculate the binding energy of substrate to the key conformations suring translocation cycle to reveal the relationship between protein conformational change and substrate translocation. By identifying the critical residues for substrate translocation, mutagenesis experiments and functional asssays will be performed to elicidate the translocation mechanism thoroughly.

ATP结合模块（ATP-binding cassette,ABC）转运体家族蛋白负责主动输运物质进出细胞膜，参与细胞的诸多重要生理过程，也是临床治疗中细菌和癌细胞抗药性的主要来源。维生素B12转运体蛋白BtuCD是ABC转运体家族转运机理研究的典型体系，本项目计划运用分子动力学模拟方法在原子水平上研究BtuCD膜蛋白构象变化的热力学和动力学，阐明底物转运机制。主要采用metadynamics等增强抽样方法计算BtuCD四个不同构象之间沿特定途径转换的自由能变化曲线（面），得到转运循环中构象变化的完整图像。研究底物结合蛋白BtuF和核苷酸分子对BtuCD构象变化的影响，澄清二者对BtuCD转运循环的调控作用。通过计算转运循环中关键蛋白构象和底物结合的自由能，阐明构象变化和底物转运的关系。分析底物转运机制中的关键氨基酸残基，通过设计突变进行实验验证，深入揭示底物转运的分子机制。

ATP-结合模块（ATP-binding cassette, ABC）转运体家族蛋白负责主动输运物质进出细胞膜，参与细胞的诸多重要生理过程，也是临床治疗中细菌和癌细胞抗药性的主要来源。本项目运用分子动力学模拟，增强采样算法和马尔科夫态模型分析等计算方法研究了维生素B12转运体蛋白BtuCD-F及同家族的ABC转运体蛋白的构象动力学和底物转运的分子机理。在BtuCD的孔道闭合状态，模拟发现底物维生素B12与孔道没有特异性的相互作用，在通道细胞外侧的门径关闭是防止底物回流的关键。底物在孔道中的位置与细胞内侧门径的打开程度具有相关性。在对BtuCD后水解体系的模拟中发现，ATP水解导致核苷结合模块结构域NBD二聚体的非对称打开，L-loop在 NBD 与跨膜区的构象变化耦合中扮演了重要的角色。模拟结果也显示底物的转运是慢速过程，与最新的实验结果吻合。我们通过大规模分子动力学模拟结合马尔科夫态模型分析，发现BtuF在底物结合前后均有很高的构象柔性，补偿底物结合的熵损失，BtuF的底物结合机制不符合底物结合蛋白的经典捕蝇草结合模型。通过增强采样的metadynamics模拟，考察了MBP激活麦芽糖输入体MalFGK2水解活性的机制。通过构象变化的自由能面计算，我们发现MBP的结合明显改变输入体蛋白构象变化的自由能面构造，使得半打开构象更加稳定，两个核苷结合模块结构域互相靠近，从而促进水解反应的发生。这一研究定量地揭示了底物结合蛋白对转运体构象变化的调控以及水解活性增强机制，同时也解释了不同实验数据之间的矛盾。最后，我们结合分子动力学模拟，马尔科夫态模型分析，核磁共振和单分子荧光共振能量转移等实验方法研究了ABC转运体家族底物结合蛋白GlnBP的构象动力学。核磁共振残余偶极耦合实验数据与分子动力学模拟的四个构象组成的系综模型相吻合，其中晶体结构之前发现的“打开”和“关闭”状态只是该系综的两种主要构象。综上所述，本项目的研究揭示了BtuCD及其家族类似蛋白的构象动力学和底物转运机制，而且发展了结合多种技术的方法，可广泛用于蛋白质构象动力学性质的研究。

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