植物铵转运蛋白泛素化调控的单分子研究

In plant cells, the ammonium acquisition and transport is mediated by AMMONIUM TRANSPORTERs (AMTs), which play essential roles in the regulation of ammonium ion balance in all organisms. Therefore, the transport activity of AMTs is strictly controlled by ammonium-triggered feedback inhibition to prevent cellular ammonium toxicity. However, the regulation mechanism of AMTs activity in living plant cells remains to be further elucidated. Based on our previous investigations, the project mainly focuses on the mechanisms of how ubiquitination regulates ammonium transporter AMT1;3 by means of dynamic analysis in the living cells together with biochemical and genetic approaches. First, we will analyze the ubiquitin-dependent degradation pathway of ammonium transporter in the presence of ammonium. Then we will elucidate the roles of ubiquitination in the dynamic properties and the endocytosis of ammonium transporter AMT1;3. Finally, we are going to investigate the intracellular trafficking affected by ubiquitin-modification. In the course of the investigation, some new methods and techniques including variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy, fluorescence correlation spectroscopy and fluorescence cross-correlation spectroscopy will be used. Taken together, the results of this study will lay foundation for the better understanding of the regulatory mechanisms of ubiquitination involved in the functional characterization of ammonium transporter proteins in plants.

植物细胞膜上铵转运蛋白(AMMONIUM TRANSPORTERS, AMTs)是植物根系吸收和转运铵根离子的重要载体，其对体内铵根离子平衡的调节是细胞能正常进行各种生理活动的基础。因此，为了防止过量摄入铵而产生的铵毒害，铵转运蛋白的活性受到严格的调控，但其调控机制尚不十分明确，仍需进一步深入研究。本项目将在我们前期研究工作的基础上，利用活体动态研究技术并结合生物化学和遗传学分析方法，对拟南芥铵转运蛋白的泛素化修饰调控机制进行研究：(1) 分析铵转运蛋白的泛素化降解途径；(2) 探讨泛素化修饰对铵转运蛋白质膜上运动状态和胞吞方式的影响；(3) 阐释泛素化修饰对铵转运蛋白的胞内转运途径的调控机制。在本项目研究中，拟采用可变角度的全内反射荧光显微术、荧光相关光谱、荧光互相关光谱等新技术，旨在揭示泛素化修饰参与调控铵转运蛋白活性的分子机制，从而为进一步阐明铵转运蛋白活性调控的机理提供新的依据。

氮素是植物合成蛋白质、核酸和一些辅助因子等含氮化合物的必需组分，植物细胞膜上的铵转运蛋白（AMT）是植物根系吸收和转运铵离子的主要负责蛋白，在拟南芥中AMTs家族共有6个成员，其中AMT1;3仅在根部特异性表达，负责根部铵根离子的吸收和转运。因此为了在农业生产中合理利用氮肥以及防止过量摄入铵而产生铵毒害，铵转运蛋白的活性受到严格的调控，但其调控机制以及泛素化修饰是否影响铵转运蛋白AMT1;3的胞吞及囊泡转运机制尚不十分明确。因此，本项目以铵转运蛋白AMT1;3为研究对象，利用活体动态研究技术结合生物化学和分子生物学等实验方法，对拟南芥铵转运蛋白的泛素化修饰调控机制进行研究，得到的主要结果如下：(1) . 在拟南芥植物体内AMT1;3蛋白存在一个本底水平的泛素化修饰；在高铵胁迫下泛素化修饰参与拟南芥中AMT1;3蛋白的降解。(2) 泛素化修饰对AMT1;3蛋白动力学参数的影响：泛素化修饰对AMT1;3在质膜上的运动模式无显著影响；高铵胁迫条件下，突变体植株AMT1;3K75K233-EGFP中AMT1;3蛋白的扩散系数显著降低，长距离扩散所占的比例显著降低，运动速率显著上升，表明在高铵胁迫下泛素化缺失影响AMT1;3在细胞质膜上的运动状态。(3) 泛素化修饰影响AMT1;3蛋白的胞吞：正常铵处理条件下AMT1;3-EGFP以及AMT1;3K75K233-EGFP突变体植株中AMT1;3蛋白的胞吞无明显差异，而在高铵胁迫条件下AMT1;3K75K233-EGFP突变体中AMT1;3蛋白的胞吞受到极显著的抑制，表明泛素化修饰影响高铵胁迫条件下AMT1;3蛋白的胞吞。(4) 泛素化修饰对铵转运蛋白AMT1;3囊泡转运途径调控的研究：在高铵胁迫条件下，突变体植株中AMT1;3蛋白主要聚集在早期内涵体 (early endosome, EE) 中，减少向晚期内涵体 (late endosome, LE) 的转运以及液泡中的降解，表明植物AMT1;3蛋白在高铵胁迫条件下其胞内循环与降解平衡机制受到影响。这些结果为进一步揭示泛素化修饰参与调控铵转运蛋白活性的分子机制，阐明铵转运蛋白活性调控的机理提供新的理论依据。

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