Cryo-kinetics Reveal Dynamic Effects on the Chemistry of Human Dihydrofolate Reductase.
Cryo-kinetics Reveal Dynamic Effects on the Chemistry of Human Dihydrofolate Reductase.
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DOI：
10.1002/cbic.202100017
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发表时间：
2021-07-15
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Allemann RK
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Adesina AS;Luk LYP;Allemann RK
同位素取代对人二氢叶酸还原酶 (HsDHFR) 速率常数的影响是抗癌药物的重要靶点，但由于其复杂的快速动力学，此前尚未得到表征。在这里，我们报告了 HsDHFR 催化反应动力学的冷冻测量结果以及蛋白质运动对催化的影响。同位素酶标记显示酶 KIE (k H LE/k H HE) 在 0°C 以上接近一致；然而，在-20°C 时，酶 KIE 增加至 1.72±0.15，这表明蛋白质运动与化学步骤的耦合在最佳条件下最小化，但在非生理温度下增强。所提出的低温方法提供了探索哺乳动物 DHFR 动力学的机会，从而为表征其过渡态结构奠定了基础。报告了人二氢叶酸还原酶 (HsDHFR) 催化反应动力学的冷冻测量结果以及蛋白质运动对催化的影响。同位素酶标记显示酶 KIE (kH LE/kH HE) 在 0°C 以上接近一致；然而，在-20°C 时，酶 KIE 增加至 1.72±0.15，这表明蛋白质运动与化学步骤的耦合在最佳条件下最小化，但在非生理温度下增强。
Effects of isotopic substitution on the rate constants of human dihydrofolate reductase (HsDHFR), an important target for anti‐cancer drugs, have not previously been characterized due to its complex fast kinetics. Here, we report the results of cryo‐measurements of the kinetics of the HsDHFR catalyzed reaction and the effects of protein motion on catalysis. Isotopic enzyme labeling revealed an enzyme KIE (k H LE/k H HE) close to unity above 0 °C; however, the enzyme KIE was increased to 1.72±0.15 at −20 °C, indicating that the coupling of protein motions to the chemical step is minimized under optimal conditions but enhanced at non‐physiological temperatures. The presented cryogenic approach provides an opportunity to probe the kinetics of mammalian DHFRs, thereby laying the foundation for characterizing their transition state structure. The results of cryo‐measurements of the kinetics of the human dihydrofolate reductase (HsDHFR) catalyzed reaction and the effects of protein motion on catalysis are reported. Isotopic enzyme labeling revealed an enzyme KIE (kH LE/kH HE) close to unity above 0 °C; however, the enzyme KIE was increased to 1.72±0.15 at −20 °C, indicating that the coupling of protein motions to the chemical step is minimized under optimal conditions but enhanced at non‐physiological temperatures.
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