A protocol for enumeration of aquatic viruses by epifluorescence microscopy using Anodisc™ 13 membranes.
A protocol for enumeration of aquatic viruses by epifluorescence microscopy using Anodisc™ 13 membranes.
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DOI：
10.1186/1471-2180-11-168
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发表时间：
2011-07-25
期刊：
影响因子：
4.2
通讯作者：
Buchan A
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Budinoff CR;Loar SN;LeCleir GR;Wilhelm SW;Buchan A
落射荧光显微镜是从环境样本中计数病毒样颗粒 (VLP) 的常用方法，依赖于使用孔径 < 0.02 μm 的滤膜；最常用的方案采用带有内置支撑环的 25 mm Anodisc™ 膜。还存在其他小孔径过滤器，包括不带支撑环的 13 mm Anodisc™ 膜。然而，之前尚未报道使用这些膜进行病毒计数。在这里，我们描述了 13 mm Anodisc 膜的修改方案，该方案使用定制的过滤器支架，可以在个别研究人员的实验室中使用市售的 Swinnex® 过滤器支架轻松构建该过滤器支架。我们比较了使用 Anodisc 膜以及 Nuclepore™ 小孔径膜（0.015 或 0.030 μm）从噬菌体裂解物和海水样品中获得的 VLP 浓度。当采用类似的染色方法时，13 mm Anodisc 膜给出的 VLP 丰度估计值与使用 25 mm Anodisc 膜获得的 VLP 丰度估计值相当。对于环境样品，两种 Nuclepore 膜的 VLP 丰度值通常要低一个数量级。 13 mm Anodisc 膜比 25 mm 膜成本更低，需要的样品量更小，这使其成为大规模研究和样品复制的理想选择。该方法增加了可用于量化环境样本中 VLP 的可靠方法的选择。
Epifluorescence microscopy is a common method used to enumerate virus-like particles (VLP) from environmental samples and relies on the use of filter membranes with pore sizes < 0.02 μm; the most commonly used protocols employ 25 mm Anodisc™ membranes with a built-in support ring. Other filters with small pore sizes exist, including the 13 mm Anodisc™ membranes without a support ring. However, the use of these membranes for viral enumeration has not been previously reported. Here we describe a modified protocol for 13 mm Anodisc membranes that uses a custom filter holder that can be readily constructed in individual investigators' laboratories from commercially available Swinnex® filter holders. We compared VLP concentrations obtained from phage lysates and seawater samples using both Anodisc membranes, as well as Nuclepore™ small pore-size membranes (0.015 or 0.030 μm). The 13 mm Anodisc membranes gave comparable estimates of VLP abundance to those obtained with the 25 mm Anodisc membranes when similar staining methods were employed. Both Nuclepore membranes typically gave an order of magnitude lower VLP abundance values for environmental samples. The 13 mm Anodisc membranes are less costly and require smaller sample volumes than their 25 mm counterpart making them ideal for large-scale studies and sample replication. This method increases the options of reliable approaches available for quantifying VLP from environmental samples.
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