Expression and purification of a single-chain Type IV restriction enzyme Eco94GmrSD and determination of its substrate preference.
Expression and purification of a single-chain Type IV restriction enzyme Eco94GmrSD and determination of its substrate preference.
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DOI：
10.1038/srep09747
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发表时间：
2015-05-19
影响因子：
4.6
通讯作者：
Xu SY
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
He X;Hull V;Thomas JA;Fu X;Gidwani S;Gupta YK;Black LW;Xu SY
首次报道的 IV 型限制性内切酶 (REase) GmrSD 由 GmrS 和 GmrD 亚基组成。然而，在大多数细菌中，gmrS 和 gmrD 基因融合在一起编码单链蛋白质。来自大肠杆菌菌株 STEC_94C 的 ECSTEC94C_1402 的融合编码序列在 T7 Express 中表达。命名为 Eco94GmrSD 的蛋白质在具有葡萄糖基-5-羟甲基-胞嘧啶 (glc-5hmC) 的 T4 DNA 和具有 5-羟甲基-胞嘧啶 (5hmC) 的 T4gt DNA 上显示出修饰依赖性 ATP 刺激的 REase 活性。通过两柱层析纯化 C 端 6xHis 标签蛋白。该酶在 Mg2+ 和 Mn2+ 缓冲液中具有活性。它更喜欢切割大的 glc-5hmC 或 5hmC 修饰的 DNA。在噬菌体限制性测定中，Eco94GmrSD 弱限制 T4 和 T4gt，而 T4 IPI* 缺陷噬菌体 (Δip1) 被限制超过 106 倍，这与 IPI* 保护大肠杆菌 DH10B 免于紧密同源的大肠杆菌 CT596 GmrSD 的致死表达一致。通过鉴定推定的 C 末端 REase 催化位点 D507-H508-N522，Eco94GmrSD 被认为属于 His-Asn-His (HNH)-核酸酶家族。 GmrSD 变体 D507A、H508A 和 N522A 没有表现出核酸内切酶活性，这也支持了这一点。大量融合 GmrSD 同源物的存在表明 GmrSD 是一种有效的噬菌体排除蛋白，提供了阻止 T-even 噬菌体感染的机制。
The first reported Type IV restriction endonuclease (REase) GmrSD consists of GmrS and GmrD subunits. In most bacteria, however, the gmrS and gmrD genes are fused together to encode a single-chain protein. The fused coding sequence for ECSTEC94C_1402 from E. coli strain STEC_94C was expressed in T7 Express. The protein designated as Eco94GmrSD displays modification-dependent ATP-stimulated REase activity on T4 DNA with glucosyl-5-hydroxymethyl-cytosines (glc-5hmC) and T4gt DNA with 5-hydroxymethyl-cytosines (5hmC). A C-terminal 6xHis-tagged protein was purified by two-column chromatography. The enzyme is active in Mg2+ and Mn2+ buffer. It prefers to cleave large glc-5hmC- or 5hmC-modified DNA. In phage restriction assays, Eco94GmrSD weakly restricted T4 and T4gt, whereas T4 IPI*-deficient phage (Δip1) were restricted more than 106-fold, consistent with IPI* protection of E. coli DH10B from lethal expression of the closely homologous E. coli CT596 GmrSD. Eco94GmrSD is proposed to belong to the His-Asn-His (HNH)-nuclease family by the identification of a putative C-terminal REase catalytic site D507-H508-N522. Supporting this, GmrSD variants D507A, H508A, and N522A displayed no endonuclease activity. The presence of a large number of fused GmrSD homologs suggests that GmrSD is an effective phage exclusion protein that provides a mechanism to thwart T-even phage infection.
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影响因子：
3.2
作者：
ALATOSSAVA, T;JUTTE, H;KELLENBERGER, E
通讯作者：
KELLENBERGER, E
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作者：
Kriukiene, Edita
通讯作者：
Kriukiene, Edita
5-羟甲基胞嘧啶 DNA 限制性内切酶 PvuRts1I 底物选择性的结构基础
DOI：
10.1107/s139900471401606x
发表时间：
2014-09
期刊：
Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography
影响因子：
--
作者：
Shao C;Wang C;Zang J
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Zang J
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DILA, D;SUTHERLAND, E;RALEIGH, EA
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RALEIGH, EA
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Pommer, AJ;Kühlmann, UC;Kleanthous, C
通讯作者：
Kleanthous, C