構造安定化変異を導入した組換えG蛋白質共役型受容体(PAR-4)の大量発現

G蛋白質共役型受容体(GPCR)は、臨床医薬の標的分子として注目されている膜蛋白質ファミリーであり、Structure-based drug designのスローガンのもと、リガンド認識機構の解明を目指して、世界各国で立体構造解析が進められている。本研究では、GPCRファミリーの中から、血小板トロンビン受容体(PAR-4)を取り上げ、立体構造研究に向けた発現・精製システムの構築に取り組んだ。本研究の最終目的は、結晶化に使用可能な、"安定かつ高品質の"組換えPAR-4蛋白質を調製することであり、これを達成するために、PAR-4蛋白質に対して"構造安定化変異"の導入を行った。また、翻訳後修飾も含め、より正確なフォールディングをとった組換え蛋白質を生産させるべく、動物細胞発現系を用いた。構造安定化変異の導入については、1)糖鎖の除去、2)末端領域の欠失変異、3)ジスルフィド結合を形成しないフリーなシステイン残基の置換などを行い、それぞれの変異体の性質を調べた。その結果、糖鎖やカルボキシ末端の領域を除去しても、活性が保持された変異体PAR-4が発現することが明らかになり、結晶化に適した"よりコンパクトな"コンストラクトを作成できる可能性が示された。一方、システイン残基については受容体活性化に関与しているためか、システイン残基をアラニン残基などに置換すると活性が失われてしまった。大量発現系については、当初PAR-4の細胞毒性が問題となったが、誘導発現システムを使用することで、安定発現株を得ることに成功した。テトラサイクリンの添加によって発現制御を行なうシステムを用いたが、これにより一過性発現時よりも高い発現が見られる安定発現株を得ることが出来た。この後、培養、発現など各ステップの条件検討を進め、アフィニティークロマトグラフィーを用いてPAR-4蛋白質の精製に取り組んだ。

G蛋白質共役型受容体(GPCR)は、臨床医薬の標的分子として注目されている膜蛋白質ファミリーであり、Structure-based drug designのスローガンのもと、リガンド認識機構の解明を目指して、世界各国で立体構造解析が進められている。本研究では、GPCRファミリーの中から、血小板トロンビン受容体(PAR-4)を取り上げ、立体構造研究に向けた発現・精製システムの構築に取り組んだ。本研究の最終目的は、結晶化に使用可能な、"安定かつ高品質の"組換えPAR-4蛋白質を調製することであり、これを達成するために、PAR-4蛋白質に対して"構造安定化変異"の導入を行った。また、翻訳後修飾も含め、より正確なフォールディングをとった組換え蛋白質を生産させるべく、動物細胞発現系を用いた。構造安定化変異の導入については、1)糖鎖の除去、2)末端領域の欠失変異、3)ジスルフィド結合を形成しないフリーなシステイン残基の置換などを行い、それぞれの変異体の性質を調べた。その結果、糖鎖やカルボキシ末端の領域を除去しても、活性が保持された変異体PAR-4が発現することが明らかになり、結晶化に適した"よりコンパクトな"コンストラクトを作成できる可能性が示された。一方、システイン残基については受容体活性化に関与しているためか、システイン残基をアラニン残基などに置換すると活性が失われてしまった。大量発現系については、当初PAR-4の細胞毒性が問題となったが、誘導発現システムを使用することで、安定発現株を得ることに成功した。テトラサイクリンの添加によって発現制御を行なうシステムを用いたが、これにより一過性発現時よりも高い発現が見られる安定発現株を得ることが出来た。この後、培養、発現など各ステップの条件検討を進め、アフィニティークロマトグラフィーを用いてPAR-4蛋白質の精製に取り組んだ。