Technology for Synthesis of Chemically Diverse RNAs

总结 RNA合成技术在基础生物医学研究中变得至关重要，并且在基于RNA的 传感器、诊断和治疗1 - 6。 目前，RNA是通过固相亚磷酰胺或 化学7，8，或通过在溶液中用噬菌体编码的RNA聚合酶转录10。 的结构多样性 化学合成的RNA受到亚磷酰胺的可用性和反应的相容性的限制 化学合成具有不同的核苷酸修饰，但化学合成更重要的限制是RNA 不能以可接受的产率制备超过几十个核苷酸11。 酶促方法允许合成 更长的RNA 12，并通过使用特别工程化的RNAPs 13 - 18，甚至允许合成具有非典型RNA的RNA。 化学增强功能性或RNA酶抗性19，20，但酶促合成的限制是化学 RNA的组成由反应中NTP的混合物均匀地确定（即，一个的不同部分 RNA不能具有不同的化学性质）。 我们最近发表了一项新的RNA合成的原理证明研究， PLOR技术（用于RNA的位置标记）结合了固相和酶促合成， 制备无限长的RNA，其中多个特异性片段或核苷酸可以用 独特的化学21. 这项技术代表了我们表征RNA结构能力的一个飞跃， RNA适体或干扰RNA，其被特异性地衍生以优化其递送、稳定性或生物相容性。 在体内的有效性，也提出了潜在的优势，效率，可能取代目前的合成方法 甚至对于常规（单一化学）RNA。 拟议的工作将优化这一效率和经济性 新技术，扩大了其用于合成具有非规范核苷酸化学的RNA的效用，并且，一般来说， 使常规和经济有效地制备新一代嵌合的、化学多样的RNA成为可能， 分子，其应用范围从基础生物医学研究到临床治疗。 1

Summary  RNA synthesis technologies have become critical in basic biomedical research, and in development of RNA‐based  sensors, diagnostics and therapeutics1‐6.  Currently, RNAs are synthesized by either solid‐phase phosphoramidite  chemistry7,8, or by transcription in solution with phage‐encoded RNA polymerases10.  The structural diversity of  chemically synthesized RNAs is limited by the availability of the phosphoramidites and the compatibility of reaction  chemistry with different nucleotide modifications, but the more important limitation of chemical synthesis is that RNAs  longer than a few tens of nucleotides cannot be made with acceptable yields11.  Enzymatic methods allow synthesis of  much longer RNAs12, and by using specially engineered RNAPs13‐18, even allow synthesis of RNAs with non‐canonical  chemistry to enhance functionality or RNAse resistance19,20, but a limitation of enzymatic synthesis is that the chemical  composition of an RNA is homogeneously determined by the mix of NTPs in the reaction (i.e., different segments of one  RNA cannot have different chemistry).  We recently published a proof‐of‐principle study for a new RNA synthesis  technology‐‐PLOR (for positional labeling of RNA)‐‐that combines solid‐phase and enzymatic synthesis to allow  preparation of indefinitely long RNAs in which multiple specific segments or nucleotides can be specifically labeled with  distinct chemistry21.  This technology represents a quantum leap in our ability to characterize RNA structure and  mechanism, to prepare RNA aptamers or interfering RNAs specifically derivatized to optimize their delivery, stability or  effectiveness in vivo, and also presents potential advantages in efficiency that may supersede current synthesis methods  even for conventional (single chemistry) RNAs.  The proposed work will optimize the efficiency and economics of this  novel technology, expand its utility for synthesis of RNAs with non‐canonical nucleotide chemistries, and, in general,  make possible the routine and economically efficient preparation of a new generation of mosaic, chemically diverse RNA  molecules with applications ranging from fundamental biomedical research to clinical therapeutics.  1