Cofactor-Mediated DNA Binding by the NF-kappaB Dimers

项目总结： 含有核因子的κB二聚体可以与位于中国的κB和DNA二聚体的特异性DNA反应元件相结合。 启动子和增强子包括数以千计的新基因，它们和增强子共同调控它们的基因表达。尽管它们大约需要10个BP。 长的κB序列将遵循一项共识，数百条特定的DNA序列不能符合最新的共识。 变异还会导致核因子-κB-DNA结合亲和力、动力学和构象的差异，从而导致癌症的发生。 转录产物的变化。事实上，我们报道的其他石油和天然气的变化就像英国石油公司的一次变化一样少。 在基因调控中有严重的影响，通过改变核因子-κB二聚体。核因子-κB：DNA复合体的亲和力是衍生出来的。 从体外实验来看，并不总是与体内的结合蛋白和基因调控有关。 这些观察结果表明，在体外培养的细胞中，不存在调节剂，而不存在它们在细胞中的包涵体。 在体内的实验和在体外的实验结果不会完全调和。另一方面，在体外没有适当的实验。 建立实验模型，对体内实验的监管机制进行适当的调查，是很难完成的。 在过去的10年里，在几家这样的公司的支持下建立起来的细胞技术实验已经进行了很长时间。 但是，如果没有彻底的生化反应，就不可能正确地解释调节器的作用机制。 以及生物物理和实验。我们将这些调节因子称为辅因子。这些辅因子可以改变DNA的结合。 核因子-κB的亲和力：κB的亲和力：异源二聚体的亲和力和同源二聚体的亲和力以特定于序列的方式表达。 这项提案的重点是利用新的实验手段，提出一个如何利用这些辅因子的统一的原则。 规范核因子-κB的活动。 我们可以建议，当一个核因子-κB：κB和复杂的DNA之间的亲和力非常弱时，一个可以发挥作用的辅因子。 积极增强核因子-κB的亲和力：通过直接或不接触核因子-κB而直接联系核糖核酸复合体。 脱氧核糖核酸使基因表达受阻。或者，一种新的辅因子可以通过去除核因子-κB的表达来发挥负面作用。 亲和力下降(或降低亲和力)。有几个积极的辅助因素，只有少数几个消极的辅助因素是未知的。 对其中几种辅因子在体外的作用模式进行研究。具体而言，我们将无法确定它们的主要作用部位。 积极因素和消极因素的相互作用影响着药物的作用，以及他们如何利用变构作用机制来改变。 DNA是由Prela结合的。由于目前尚不清楚与P50有关的辅助因素和具体作用，因此我们也不计划进一步确定哪些辅助因素和特定的影响因素。 为了调整p50亚基，并调查这些新的辅助因子是否会与特定的辅助因子一起发挥作用，以及这些辅助因子是如何发挥作用的。 我们还将在辅因子结合基因中产生新的突变基因和缺陷基因，并测试基因如何表达和表达。 细胞中的DNA结合蛋白会改变细胞对特定细胞刺激的反应。

Project Summary  The  NF-­  κB  dimers  bind  to  specific  DNA  response  elements  known  as  the  κB  DNA  sites  located  in  the  promoters and enhancers of thousands of genes, and regulate their expression. Although the roughly 10 bp  long  κB  sequences  follow  a  consensus, hundreds  of  specific  sequences  can  fit  the  consensus.  Sequence  variations  can  result  in  differences  in  NF-­κB-­DNA  binding  affinity,  kinetics  and  conformations  leading  to  changes  in  transcriptional  output.  Indeed,  other  and  we  reported  that  as  few  as  a  single  bp  change  can  have severe effect in gene regulation by the NF-­κB dimers. Affinities of the NF-­κB:DNA complexes derived  from  in  vitro  experiments  do  not  always  correlate  with  in  vivo  binding  and  gene  regulation.  These  observations  suggest  that  there  are  modulators  present  in  the  cell  and  without  their  inclusion  in  in  vitro  experiments  in  vivo  and  in  vitro  results  will  not  reconcile.  On  the  other  hand,  without  proper  in  vitro  experimental  set  up,  proper  investigation  of  regulatory  mechanisms  in  vivo  is  difficult  to  accomplish.  Cellular  experiments  performed  over  the  past  10  years  established  the  presence  of  several  of  such  modulators,  but  their  mechanisms  of  action  could  not  be  properly  explained  without  thorough  biochemical  and  biophysical  experiments.  We  term  these  modulators  cofactors.  These  cofactors  alter  the  DNA  binding  affinity  of  NF-­κB  p50:RelA  heterodimer  and  RelA  homodimers  in  a  κB  sequence-­specific  manner.  The  focus  of  this  proposal  is  to  use  new  experiments  to  propose  a  unifying  principle  of  how  the  cofactors  regulate NF-­κB activity.   We  propose  that  when  the  affinity  between  an  NF-­κB:κB  DNA  complex  is  weak,  a  cofactor  can  act  positively  enhancing  the  affinity  of  NF-­κB:DNA  complexes  by  directly  contacting  NF-­κB  without  contacting  DNA  allowing  gene expression  to occur. Alternatively, a  cofactor  can act  negatively  by  removing  NF-­κB  off  the  DNA  (or  reduce  affinity).  Several  positive  cofactors  and  few  negative  cofactors  are  known.  We  will  investigate  the  mode  of  actions  of  a  few  of  these  cofactors  in  vitro.  Specifically,  we  will  identify  the  site  of  interaction of both  positive  and  negative  cofactors  on  RelA and how they use  allosteric  mechanism to alter  DNA binding by RelA. Since no cofactor specific to p50 is known, we also plan to identify cofactors specific  to the p50 subunit and investigate if and how these new cofactors act together with RelA-­specific cofactors.  We  will  generate  mutants  of  RelA  defective  in  cofactor  binding  and  test  how  gene  expression  profile  and  DNA binding in cells alters in response to specific stimulus.