The exocyst in ureter development and congenital obstructions

项目总结： -- 先天性梗阻性肾小球肾炎(CON)是慢性肾小球疾病最常见的病因。 儿童肾脏疾病的阶段，主要是由于胎儿发育过程中尿路梗阻所致。 输尿管肾盂输尿管连接部梗阻(UPJO)是最常见的输尿管连接部梗阻，通常发生在梗阻的部位。 肾与输尿管相连。尽管医疗负担很高，但我们对这一问题的认识仍然很差。 分子生物学和基因工程导致了UPJO的死亡，尤其是极少数非手术的动物模型。他们使用的是体外细胞移植模型。 我们已经证明，这八个蛋白质胞囊和贩运的复杂结构对于上皮细胞的生长机制来说是非常重要的。 形态发生。为了更好地促进在体内对哺乳动物胚胎发育过程中胞囊的研究，我们还没有。 利用Cre-lox和转基因技术，产生了一种新的有条件基因敲除小鼠的基因，用于检测Cre-lox和Sec10亚基的排泄物。 技术。我们的目标是在输尿管胚芽来源的上皮细胞中删除Sec10基因，而不是使用我们的Floated-Sec10基因(Sec10FL)。 而在KSP-CRE小鼠体内，这一病毒株在宫内和双侧UPJO引起肾积水，以及完全性尿失禁、尿失禁。 新生儿死亡率。初步临床研究显示，Sec10FL/FL；;KSP-？CRE基因敲除输尿管和尿路上皮未成功。 在妊娠期16.5天(E16.5)和E17.5天(E17.5)之间区分一个较浅的细胞层。这导致了尿路上皮细胞。 死亡和尿液渗漏是尿路上皮细胞对尿液的屏障，随着TGFb1基因表达的增加和间质干细胞的增加。 增殖。由E18.5发现，由于基质重塑和过度生长，UPJ会展中心的输尿管和管腔被完全消除。 根据这些研究结果，我们可以假设，排囊和贩运是建立这种机制所必需的。 在胚胎输尿管中，功能正常的尿路上皮细胞，以及尿路上皮细胞屏障的失败，激活了一个新的致病创面。 治疗和反应是指它迅速堵塞输尿管和管腔。我们将通过以下测试来检验这一假说。 目的：(1)了解外囊依赖膜中的缺陷是如何导致被捕的。 尿路上皮细胞分化和细胞死亡。我们的初步数据显示，E-cadherin未能将流量传导到细胞-细胞。 在E16.5和Sec10FL/FL；;KSP-？CRE和尿路上皮细胞之间存在连接。在这里，我们将不能确定SEC10缺失是否是原因。 扰乱了其他关键的细胞-细胞连接蛋白的运输，以及这是如何扰乱尿路上皮细胞的正常机制的。 我们还将测试在胚胎发育过程中E-钙粘附素的缺失率是否会改变。 输尿管结石有足够的证据来概括UPJO的表型。我们(2)要找出驱动输尿管结石的主要致病机制。 间充质干细胞扩张是导致UPJO在Sec10FL/FL；;KSP-？CRE输尿管中的主要原因。我们将继续测试尿路上皮细胞。 在输尿管发育的关键阶段，细胞死亡是不足以导致UPJO表型的。我们将继续利用这一技术。 新的体外输尿管移植模型用于测试尿液是否有助于促进纤维增生性疾病的发生。 最后，我们将在体内阻断TGFb1-Smad2/3信号转导通路，以确定我们是否可以进一步改善UPJO的表型。 在SEC10FL/FL；;KSP-CRE小鼠中。这项新提案的主要预期结果是确定主要的分子生物学机制。 这可能会导致UPJO在这个新的小鼠模型中出现问题，这将对我们对人类的进一步理解产生很大的影响。 输尿管和输尿管治疗的开发公司将继续为新的治疗方法的开发奠定基础。

PROJECT SUMMARY    Congenital  obstructive  nephropathy  (CON),  the  most  common  cause  of  chronic  kidney  disease  and  end  stage  renal  disease  in  children,  is  caused  by  obstruction  of  the  urinary  tract  during  fetal  development.    The  most common form of CON is ureteropelvic junction obstruction (UPJO), when the blockage occurs where the  renal  pelvis  connects  to  the  ureter.    Despite  the  high  medical  burden,  we  have  a  poor  understanding  of  the  molecular and genetic causes of UPJOs, with very few non-­surgical animal models.  Using in vitro cell models,  we  have  shown  the  eight-­protein  exocyst  trafficking  complex  to  be  important  for  mechanisms  of  epithelial  morphogenesis.    To  facilitate  in  vivo  studies  of  the  exocyst  during  mammalian  development,  we  have  generated  a  novel  conditional  knockout  mouse  for  the  exocyst  subunit  Sec10  using  Cre-­lox  transgenic  technology.    Targeted  deletion  of  Sec10  in  ureteric  bud-­derived  epithelia,  using  our  floxed-­Sec10  (Sec10FL)  and  the  Ksp-­Cre  mouse  strains,  caused  in  utero  bilateral  UPJOs  with  hydronephrosis,  complete  anuria,  and  neonatal  lethality.    Preliminary  studies  revealed  Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre  knockout  ureter  urothelium  failed  to  differentiate  a  superficial  layer  between  gestational  day  16.5  (E16.5)  and  E17.5.    This  led  to  urothelial  cell  death and a leaky urothelial barrier against urine, with an increase in TGFb1 expression and mesenchymal cell  proliferation.  By E18.5, the ureter lumen at the UPJ was obliterated due to stromal remodeling and overgrowth  of fibroblastic cells.  Based on these findings, we hypothesize that exocyst trafficking is necessary to establish  a functional urothelium in embryonic ureters, and failure of the urothelial barrier activates a pathogenic wound  healing  response  that  rapidly  occludes  the  ureter  lumen.    We  will  test  this  hypothesis  through  the  following  Aims:  (1)  Understand  how  defects  in  exocyst-­dependent  membrane  trafficking  lead  to  arrested  urothelial  differentiation  and  cell  death.    Our  preliminary  data  show  E-­cadherin  fails  to  traffic  to  cell-­cell  junctions  in  the  E16.5  Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre  urothelial  cells.    Here,  we  will  determine  if  Sec10  deletion  causes  disrupted  trafficking  of  other  key  cell-­cell  junction  proteins  and  how  this  perturbs  the  mechanism  of  urothelial  barrier formation and the dynamics of stratification.  We will also test if deletion of E-­cadherin in the embryonic  ureter is sufficient to recapitulate the UPJO phenotype.  (2) Identify the pathogenic mechanism driving the  mesenchymal  expansion  responsible  for  UPJOs  in  Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre  ureters.    We  will  test  if  urothelial  cell death at critical stages of ureter development is sufficient to cause the UPJO phenotype.  We will utilize a  novel  ex  vivo  ureter  explant  model  to  test  if  urine  contributes  to  the  pathogenic  fibroproliferative  response.   Finally, we will block TGFb1-­SMAD2/3 signaling in vivo to determine if we can ameliorate the UPJO phenotype  in Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre mice.  The anticipated outcome of this proposal is identifying the molecular mechanisms  that cause prenatal UPJO in this mouse model, which will have a high impact on our understanding of human  ureter development and CON, and will lay the groundwork for development of novel therapies.