R-loop-induced DNA damage during immunoglobulin class switch recombination

项目总结/摘要 类别转换重组（CSR）是B细胞转换抗体同种型的遗传过程 通过位点特异性的染色体内DNA重排产生， 免疫球蛋白重链（IgH）基因座处的DNA双链断裂（DSB）。DSB是 正常情况下通过非同源末端连接（NHEJ）和交替末端连接（alt-HEJ）修复. DNA修复途径在CSR期间，DSB的形成受到高度调节，涉及以下因素的复杂相互作用： 转录激活、蛋白质募集和染色质重组。了解因素 调节DSB的形成和修复对淋巴瘤的发生有很大的影响。R循环是三个 在CSR过程中，IgH处形成了RNA：DNA杂交结构。虽然R环与 促进DSB在IgH的形成，它们在类别转换重组中的作用仍然不确定。我们发现 R环缺失的小鼠在类别转换重组方面是熟练的，然而B细胞 含有未修复的断裂和IgH处的染色体融合。复发性癌基因易位 涉及IgH的恶性淋巴瘤与许多人类淋巴系统恶性肿瘤不同。这些易位来源于 错配修复正常淋巴细胞发育过程中产生的DNA双链断裂（DSB）。 我们的目标是确定持续的R环如何在CSR过程中阻碍DNA修复，以及R环在CSR中的作用。 代谢在抑制IgH的基因组不稳定性中起作用。我们假设持续的R环 通过免疫球蛋白重链处的非同源末端连接阻断有效的DNA修复 基因座在类别转换重组，导致持久的，未修复的断裂。为了验证这一 假设，将采用两种小鼠模型：SETX突变体缺乏Senataxin（SETX） 解旋R环的解旋酶; RNase 2b和RNaseH 2核酸酶是缺陷的，RNaseH 2核酸酶特异性 描述了R环的RNA组分（RNH 2B）。我们将从功能上剖析 在SETX-β/β中CSR期间产生的DNA修复和染色体融合中的异常R环形成， RNH 2Bf/f和SETX-β/β-RNH 2Bf/f细胞（目的1）。为了定义持续R循环对NHEJ的影响， 我们将描述SETX-β/-β、RNH 2Bf/f和SETX-β/-β RNH 2Bf/f细胞中DNA修复蛋白的募集 (Aim 2）。我们还将使用高通量PCR技术鉴定IgH易位所涉及的基因组位点 全基因组易位测序（HTGTS-SEQ），与Feyredoun博士合作 霍莫兹迪亚里最后，我们将定义驱动频繁染色体融合的分子途径 在SETX-α/β RNH 2Bf/f细胞中观察到（目的3）。我们的工作将定义持久R循环如何干扰 类开关重组，导致未修复的断裂，并将揭示分子 促进IgH处染色体融合的机制。调节R环代谢的酶也将 为开发新的癌症治疗提供了有吸引力的靶点。

Project Summary/Abstract    Class switch recombination (CSR) is a genetic process where a B cell switches antibody isotype  production through site-­specific intra-­chromosomal DNA rearrangement stimulated by the formation  of DNA double-­strand breaks (DSBs) at the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus. DSBs are  normally repaired by the non-­homologous end-­joining (NHEJ) and alternative-­end joining (alt-­EJ)  DNA repair pathways. During CSR, DSB formation is highly regulated involving a complex interplay of  transcriptional activation, protein recruitment and chromatin reorganization. Understanding the factors  regulating DSB formation and repair has a high impact on lymphomagenesis. R loops are three  stranded RNA:DNA hybrid structures formed at IgH during CSR. While R loops are implicated in  promoting DSB formation at IgH, their role in class switch recombination remains undefined. We find  that mice defective for R loop removal are proficient at class switch recombination, however B cells  contain unrepaired breaks and chromosome fusions at IgH. Recurrent oncogenic translocations  involving IgH distinguish many human lymphoid malignancies. These translocations originate from  mis-­repaired DNA double stand breaks (DSBs) generated during normal lymphocyte development.  Our goal is to determine how persistent R loops impede DNA repair during CSR, and the role R loop  metabolism plays in suppressing genome instability at IgH. We hypothesize that persistent R loops  block efficient DNA repair by non-­homologous end joining at the immunoglobulin heavy chain  locus during class switch recombination, leading to persistent, unrepaired breaks. To test this  hypothesis, two mouse models will be employed: the SETX mutant lacks the Senataxin (SETX)  helicase that unwinds R loops;; and Rnaseh2b is defective for the RNase H2 nuclease that specifically  digests the RNA component of R loops (RNH2B). We will functionally dissect the consequences of  aberrant R loop formation on DNA repair and chromosome fusions arising during CSR in SETX-­/-­,  RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 1). To define the impact persistent R loops have on NHEJ,  we will characterize DNA repair protein recruitment in SETX-­/-­, RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells  (Aim 2). We will also identify genomic loci involved in IgH translocations using high-­throughput  genome-­wide translocation sequencing (HTGTS-­Seq), in collaboration with Dr. Feyredoun  Hormozdiari. Finally, we will define the molecular pathways driving the frequent chromosome fusions  observed in SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 3). Our work will define how persistent R loops interfere with  class switch recombination, leading to unrepaired breaks, and will uncover the molecular  mechanisms promoting chromosome fusions at IgH. Enzymes regulating R loop metabolism will also  provide an attractive target for developing novel cancer treatment.