R-loop-induced DNA damage during immunoglobulin class switch recombination

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Summary/Abstract    Class switch recombination (CSR) is a genetic process where a B cell switches antibody isotype  production through site-­specific intra-­chromosomal DNA rearrangement stimulated by the formation  of DNA double-­strand breaks (DSBs) at the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus. DSBs are  normally repaired by the non-­homologous end-­joining (NHEJ) and alternative-­end joining (alt-­EJ)  DNA repair pathways. During CSR, DSB formation is highly regulated involving a complex interplay of  transcriptional activation, protein recruitment and chromatin reorganization. Understanding the factors  regulating DSB formation and repair has a high impact on lymphomagenesis. R loops are three  stranded RNA:DNA hybrid structures formed at IgH during CSR. While R loops are implicated in  promoting DSB formation at IgH, their role in class switch recombination remains undefined. We find  that mice defective for R loop removal are proficient at class switch recombination, however B cells  contain unrepaired breaks and chromosome fusions at IgH. Recurrent oncogenic translocations  involving IgH distinguish many human lymphoid malignancies. These translocations originate from  mis-­repaired DNA double stand breaks (DSBs) generated during normal lymphocyte development.  Our goal is to determine how persistent R loops impede DNA repair during CSR, and the role R loop  metabolism plays in suppressing genome instability at IgH. We hypothesize that persistent R loops  block efficient DNA repair by non-­homologous end joining at the immunoglobulin heavy chain  locus during class switch recombination, leading to persistent, unrepaired breaks. To test this  hypothesis, two mouse models will be employed: the SETX mutant lacks the Senataxin (SETX)  helicase that unwinds R loops;; and Rnaseh2b is defective for the RNase H2 nuclease that specifically  digests the RNA component of R loops (RNH2B). We will functionally dissect the consequences of  aberrant R loop formation on DNA repair and chromosome fusions arising during CSR in SETX-­/-­,  RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 1). To define the impact persistent R loops have on NHEJ,  we will characterize DNA repair protein recruitment in SETX-­/-­, RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells  (Aim 2). We will also identify genomic loci involved in IgH translocations using high-­throughput  genome-­wide translocation sequencing (HTGTS-­Seq), in collaboration with Dr. Feyredoun  Hormozdiari. Finally, we will define the molecular pathways driving the frequent chromosome fusions  observed in SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 3). Our work will define how persistent R loops interfere with  class switch recombination, leading to unrepaired breaks, and will uncover the molecular  mechanisms promoting chromosome fusions at IgH. Enzymes regulating R loop metabolism will also  provide an attractive target for developing novel cancer treatment.