R-loop-induced DNA damage during immunoglobulin class switch recombination

免疫球蛋白类别转换重组过程中 R 环诱导的 DNA 损伤

• 批准号: 10457910
• 负责人: Jacqueline Barlow
• 金额: $ 31.4万
• 依托单位: UNIVERSITY OF CALIFORNIA AT DAVIS
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2019-08-05 至 2024-07-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/10457910
• 关键词: Animal Model; Antibodies; Automobile Driving; B-Lymphocytes; Biology; Cell physiology; Cells; Cellular biology; Chromatin; Chromosome Fragile Sites; Collaborations; Complex; DNA; DNA Damage; DNA Double Strand Break; DNA Repair; DNA Repair Gene; DNA Repair Pathway; DNA Sequence Rearrangement; Defect; Development; Dissection; Enzymes; Event; Excision; Frequencies; G22P1 gene; Gene Rearrangement; Generations; Genetic Processes; Genetic Transcription; Genomic Instability; Genomics; Goals; Heavy-Chain Immunoglobulins; Human; Hybrids; Hypersensitivity; IGH@ gene cluster; Immunoglobulin Class Switching; Immunoglobulin Switch Recombination; Immunoglobulins; Ligase; Location; Lymphocyte; Lymphomagenesis; Malignant Neoplasms; Malignant lymphoid neoplasm; Maps; Mediating; Metabolism; Molecular; Monitor; Mus; Mutation; Nonhomologous DNA End Joining; Oncogenic; Pathway interactions; Pharmaceutical Preparations; Play; Production; Proteins; RAD52 gene; RNA; Recurrence; Research Personnel; Ribonucleases; Ribonucleotides; Role; SETX gene; Site; Structure; Techniques; Testing; Transcriptional Activation; Work; cancer cell; cancer therapy; chromosome fusion; defined contribution; experience; genome-wide; genomic locus; helicase; homologous recombination; inhibitor; innovation; insertion/deletion mutation; insight; mouse model; mutant; novel; nuclease; public health relevance; recruit; repaired; replication stress; synergism; tumorigenesis

Project Summary/Abstract    Class switch recombination (CSR) is a genetic process where a B cell switches antibody isotype  production through site-­specific intra-­chromosomal DNA rearrangement stimulated by the formation  of DNA double-­strand breaks (DSBs) at the immunoglobulin heavy chain (IgH) locus. DSBs are  normally repaired by the non-­homologous end-­joining (NHEJ) and alternative-­end joining (alt-­EJ)  DNA repair pathways. During CSR, DSB formation is highly regulated involving a complex interplay of  transcriptional activation, protein recruitment and chromatin reorganization. Understanding the factors  regulating DSB formation and repair has a high impact on lymphomagenesis. R loops are three  stranded RNA:DNA hybrid structures formed at IgH during CSR. While R loops are implicated in  promoting DSB formation at IgH, their role in class switch recombination remains undefined. We find  that mice defective for R loop removal are proficient at class switch recombination, however B cells  contain unrepaired breaks and chromosome fusions at IgH. Recurrent oncogenic translocations  involving IgH distinguish many human lymphoid malignancies. These translocations originate from  mis-­repaired DNA double stand breaks (DSBs) generated during normal lymphocyte development.  Our goal is to determine how persistent R loops impede DNA repair during CSR, and the role R loop  metabolism plays in suppressing genome instability at IgH. We hypothesize that persistent R loops  block efficient DNA repair by non-­homologous end joining at the immunoglobulin heavy chain  locus during class switch recombination, leading to persistent, unrepaired breaks. To test this  hypothesis, two mouse models will be employed: the SETX mutant lacks the Senataxin (SETX)  helicase that unwinds R loops;; and Rnaseh2b is defective for the RNase H2 nuclease that specifically  digests the RNA component of R loops (RNH2B). We will functionally dissect the consequences of  aberrant R loop formation on DNA repair and chromosome fusions arising during CSR in SETX-­/-­,  RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 1). To define the impact persistent R loops have on NHEJ,  we will characterize DNA repair protein recruitment in SETX-­/-­, RNH2Bf/f, and SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells  (Aim 2). We will also identify genomic loci involved in IgH translocations using high-­throughput  genome-­wide translocation sequencing (HTGTS-­Seq), in collaboration with Dr. Feyredoun  Hormozdiari. Finally, we will define the molecular pathways driving the frequent chromosome fusions  observed in SETX-­/-­ RNH2Bf/f cells (Aim 3). Our work will define how persistent R loops interfere with  class switch recombination, leading to unrepaired breaks, and will uncover the molecular  mechanisms promoting chromosome fusions at IgH. Enzymes regulating R loop metabolism will also  provide an attractive target for developing novel cancer treatment.

项目摘要/摘要    类别转换重组 (CSR) 是 B 细胞转换抗体同种型的遗传过程  通过由形成刺激的位点特异性染色体内 DNA 重排产生  免疫球蛋白重链 (IgH) 位点处的 DNA 双链断裂 (DSB)。 DSB 是  通常由非同源末端连接 (NHEJ) 和替代末端连接 (alt-EJ) 修复  DNA 修复途径。 在 CSR 期间，DSB 的形成受到严格监管，涉及以下因素的复杂相互作用：  转录激活、蛋白质募集和染色质重组。 了解因素  调节 DSB 形成和修复对淋巴瘤发生有很大影响。 R 循环有 3 个  在 CSR 过程中，IgH 处形成链状 RNA：DNA 杂合结构。 While R 循环涉及  促进 IgH 处 DSB 的形成，但它们在类别转换重组中的作用仍不确定。 我们发现  R 环去除缺陷的小鼠擅长类别转换重组，但是 B 细胞  IgH 处含有未修复的断裂和染色体融合。 复发性致癌易位  涉及 IgH 来区分许多人类淋巴恶性肿瘤。 这些易位源自  正常淋巴细胞发育过程中产生的错误修复 DNA 双链断裂 (DSB)。  我们的目标是确定 R 环在 CSR 过程中如何阻碍 DNA 修复，以及 R 环的作用  新陈代谢在抑制 IgH 基因组不稳定性方面发挥着作用。 我们假设持久的 R 循环  通过免疫球蛋白重链上的非同源末端连接来阻断有效的 DNA 修复  类切换重组期间的位点，导致持续的、未修复的断裂。 要测试这个  假设，将采用两种小鼠模型：SETX 突变体缺乏 Senataxin (SETX)  解旋 R 环的解旋酶；；Rnaseh2b 对 RNase H2 核酸酶有缺陷，该核酸酶专门  消化 R 环 (RNH2B) 的 RNA 成分。 我们将从功能上剖析以下后果  SETX-/- 中 CSR 期间出现的 DNA 修复和染色体融合异常 R 环形成，  RNH2Bf/f 和 SETX-/- RNH2Bf/f 细胞（目标 1）。 为了定义持续 R 环对 NHEJ 的影响，  我们将描述 SETX-/-、RNH2Bf/f 和 SETX-/- RNH2Bf/f 细胞中 DNA 修复蛋白招募的特征  （目标 2）。 我们还将使用高通量鉴定参与 IgH 易位的基因组位点  与 Feyredoun 博士合作进行全基因组易位测序 (HTGTS-Seq)  霍尔莫兹迪亚里。 最后，我们将定义驱动频繁染色体融合的分子途径  在 SETX-/- RNH2Bf/f 细胞中观察到（目标 3）。 我们的工作将定义持久 R 循环如何干扰  类别转换重组，导致未修复的断裂，并将揭示分子  IgH 促进染色体融合的机制。 调节 R 环代谢的酶也会  为开发新型癌症治疗方法提供了一个有吸引力的目标。