The function of kidney specific (KS)-WNK1 condensates during potassium stress

项目总结/摘要 钾[K+]缺乏的饮食导致了高血压和慢性肾脏病的全球流行 病（CKD）。考虑到增加膳食[K+]的低成本和容易性，需要更多的研究来了解 [K+]失衡如何导致这些疾病。肾脏处理90%的[K+]，远曲小管 (DCT)通过WNK-β SPAK（与-β NO-β赖氨酸/Ste 20/SPS-β 1-β相关的脯氨酸-β丙氨酸-β丰富）作为[K+]传感器 蛋白激酶）途径。 该途径的获得性高血压功能突变导致严重的高血压， 高钾血症通过激活噻嗪类药物敏感的钠/氯共转运蛋白（NCC）。奇怪的是，饮食[K+] 耗尽或负载导致WNK-1 SPAK激酶组装成大的DCT-T特异性细胞质斑点， 这在正常血钾饮食的小鼠中是看不到的。 多年来，这些冷凝物的结构和功能， 我们称之为“WNK体”，仍然是个谜Boyd-Shiwarski博士的初步工作已经确定这些DCT-DNA 特异性斑点（i）依赖于肾特异性（KS）-KWNK 1的表达;（ii）钾敏感性; 无细胞膜;（iv）与常规细胞器不相关;（v）与WNK-细胞SPAK蛋白相关。 基于这些发现，我们假设WNK小体是无膜微区， 钾失衡期间WNK-β SPAK通路调节WNK信号传导。这一假设将在 两个目的是评价WNK小体形成的生理意义和生物学基础。这个提议 基于生理学的目标将为Boyd-Shiwarski博士提供使用动物模型的机会，并且（i） 实施离体显微镜技术，（ii）量化尿液、血清和血压的变化，以及（iii） 开发转基因小鼠模型。 鉴于，本提案中基于生物学的部分将包括 实施（i）分子克隆，（ii）蛋白质生物化学，和（iii）质谱和RNA Seq. 这些技能将得到一个由导师、顾问、合作者和核心资源组成的团队的加强。 匹兹堡大学。 主要导师Arohan Subramanya博士是一位由NIH R 01-R 01资助的 医生-生物科学家，在WNK信号传导生物学方面拥有13年的经验， 20名学员。 共同导师汤姆·克莱曼博士是一位国际公认的内科科学家， 匹兹堡肾脏研究中心，并指导了9名职业发展获奖者和5名R 01 在过去的10年里， 此外，一个由有成就的调查人员组成的咨询委员会， 高血压，WNK-SPAK信号传导和肾小管转运方面的专业知识将监测Boyd-Shiwarski博士的 通过一年两次的会议取得进展。博伊德·希沃斯基博士将利用这一提议来实现她的短期目标 她的长期目标是成为一名拥有专业知识的终身制医生和科学家 钾稳态、高血压和慢性肾病。该提案的结果将构成R 01的基础 研究KS-β WNK 1-β依赖性WNK体在人类肾病模型中的翻译作用。

PROJECT SUMMARY/ABSTRACT   Potassium  [K+]-­deficient  diets  have  contributed  to  the  global  epidemic  of  hypertension  and  chronic  kidney  disease (CKD). Given the low cost and ease of increasing dietary [K+], more research is needed to understand  how [K+] imbalance leads to these diseases. The kidneys handle 90% of [K+], and the distal convoluted tubule  (DCT)  acts  as  a  [K+]  sensor  via  the  WNK-­SPAK  (With-­No-­Lysine/Ste20/SPS-­1-­related  proline-­alanine-­rich  protein  kinase)  pathway.  Gain-­of-­function  mutations  to  this  pathway  lead  to  severe  hypertension  and  hyperkalemia by activation of the thiazide-­sensitive sodium/chloride co-­transporter (NCC). Curiously, dietary [K+]  depletion  or  loading  causes  the  WNK-­SPAK  kinases  to  assemble  into  large  DCT-­specific  cytoplasmic  puncta,  that  are  not  seen  in  mice  on  normokalemic  diets.  For  years,  the  structure  and  function  of  these  condensates,  which we call “WNK bodies”, remained a mystery. Dr. Boyd-­Shiwarski’s initial work has identified that these DCT-­ specific puncta are (i) dependent upon the expression of kidney specific (KS)-­WNK1 (ii) potassium-­sensitive;; (iii)  membrane-­less;; (iv) not associated with conventional organelles;; and (v) associated with WNK-­SPAK proteins.  Based on these findings, we hypothesize that WNK bodies are membrane-­less microdomains that sequester the  WNK-­SPAK pathway to modulate WNK signaling during potassium imbalance. This hypothesis will be tested in  two aims that evaluate the physiological significance and biological basis of WNK body formation. This proposal’s  physiology-­based  aim  will  provide  Dr.  Boyd-­Shiwarski  with  the  opportunity  to  work  with  animal  models  and  (i)  implement  ex  vivo  microscopy  techniques,  (ii)  quantify  changes  in  urine,  serum,  and  blood  pressure,  and  (iii)  develop  transgenic  mouse  models.  Whereas,  the  biology-­based  portion  of  this  proposal  will  include  implementation  of  (i)  molecular  cloning,  (ii)  protein  biochemistry,  and  (iii)  mass  spectrometry  and  RNA  Seq.  These skills will be reinforced by a team of mentors, advisors, collaborators, and core resources available at the  University  of  Pittsburgh.  The  primary  mentor,  Dr.  Arohan  Subramanya,  is  an  established  NIH  R01-­funded  physician-­scientist  with  13  years  of  experience  in  WNK  signaling  biology  and  prior  experience  mentoring  over  20  trainees.  The  co-­mentor,  Dr.  Tom  Kleyman,  is  an  internationally  recognized  physician  scientist  who  directs  the Pittsburgh Center for Kidney Research, and has mentored nine career development awardees and five R01  recipients  within  the  last  10  years.  In  addition,  an  advisory  committee  of  accomplished  investigators  with  expertise  in  hypertension,  WNK-­SPAK  signaling,  and  renal  tubular  transport  will  monitor  Dr.  Boyd-­Shiwarski’s  progress through biannual meetings. Dr. Boyd-­Shiwarski will use this proposal to accomplish her short-­term goal  of scientific independence and her long-­term goal of becoming a tenure track physician-­scientist with expertise  in potassium homeostasis, hypertension, and CKD. The results from this proposal will form the basis for an R01  studying the translational role of KS-­WNK1-­dependent WNK bodies in human models of nephropathy.