Arg and cortactin regulation of the Arp2/3 complex and its role in dendritic spine stability

项目摘要 树突棘稳定性在精神和神经疾病中被破坏。树突棘富含 高度分支的细胞骨架，包含稳定和动态的丝状肌动蛋白（F-actin）池和单体肌动蛋白。 树突棘中的β 2/Arg非β受体酪氨酸激酶（Arg）及其相互作用伴侣cornein的缺失 导致青春期后期广泛的脊柱缺失，但这两种蛋白质如何支持的机制 树突棘稳定性仍然难以捉摸。 我们的实验室最近发现，使用全内反射显微镜 （TIRFM）基于单丝的测定，Arg和cornein协同调节Arp 2/3-actin介导的肌动蛋白 分支 Arp 2/3复合物通过Arg和cornein的协调调节是一种合理的机制， 这些蛋白质支持脊柱的稳定性。在我的研究计划中，我将检验Arg和corn 相互作用，通过调节Arp 2/3复合物和维持树突棘的稳定性， 稳定肌动蛋白池。 目标1.确定精氨酸如何与coronin和Arp 2/3复合物相互作用以促进肌动蛋白分支 成核 Arg如何调节Arp 2/3复合物以及corneumn如何与Arp 2/3复合物协调仍然没有解决。 Arg来增强这种效果。 为了解决Arg如何调节复合物，我将学习如何进行功能性 基于TIRFM单丝的测定，以确定足以激活Arp 2/3的Arg的最小结构域 复杂.我的初步数据表明，Arg可以直接结合Arp 2/3复合物。我将扩大这些约束力 分析和学习如何进行化学交联实验，以确定（1）最小的精氨酸片段 可以与Arp 2/3复合物进行高亲和力相互作用的亚结构域，以及（2）通过其 Arg分别与Arp 2/3复合物相互作用。最后，我将开发两种方法来确定corneum 可与Arg协同作用，激活Arp 2/3。 双色单分子TIRF检测将解决以下问题： corneumn将Arg募集到分支点，竞争结合试验将确定corneumn是否起作用 （机械地）从新生分支点释放Arg，允许细丝伸长。 目标二。 确定精氨酸和皮质醇调节脊柱稳定性的机制。 Arg， coronin和Arp 2/3复合物集中在树突棘中并且每一个都是棘稳定性所需的， 但是它们如何相互作用以赋予这种稳定性尚不清楚。实验室收集的初步数据表明， 在树突棘不稳定之前，皮质蛋白的损失最初降低了稳定的F-肌动蛋白。使用定义良好的Arg或 corptin突变体，我将进行敲除/互补和共聚焦显微镜在培养海马 神经元，以确定Arp 2/3复合物调节的中断如何影响脊柱动态行为和稳定性。 我将使用绿色荧光蛋白-肌动蛋白荧光恢复后光漂白（FRAP），采用我的方法， 合作者，与相同的突变队列，以确定这些蛋白质如何影响脊柱稳定性，通过控制 稳定和动态肌动蛋白池。

Project Summary   Dendritic spine stability is disrupted in psychiatric and neurological disorders. Dendritic spines are enriched in a  highly branched cytoskeleton, containing stable and dynamic filamentous-­ (F-­) actin pools and monomeric actin.  Loss of the Abl2/Arg non-­receptor tyrosine kinase (Arg) and its interaction partner cortactin from dendritic spines  causes  widespread  spine  loss  in  late  adolescence,  but  the  mechanisms  of  how  these  two  proteins  support  dendritic  spine  stability  remain  elusive.  Our  lab  recently  showed,  using  total  internal  reflection  microscopy  (TIRFM)  single-­filament  based  assays,  that  Arg  and  cortactin  synergize  to  regulate  Arp2/3-­mediated  actin  branching.  Coordinated  regulation  of  the  Arp2/3  complex  via  Arg  and  cortactin  is  a  plausible  mechanism  by  which these proteins support spine stability. In my research plan, I will test the hypothesis that Arg and cortactin  interact  to  confer  dendritic  spine  stability  via  regulation  of  the  Arp2/3  complex  and  maintenance  of  the  spine  stable actin pool.  Aim 1. To determine how Arg interacts with cortactin and the Arp2/3 complex to promote actin branch  nucleation.  It  remains  unresolved  how  Arg  regulates  the  Arp2/3  complex  and  how  cortactin  coordinates  with  Arg  to  enhance  this  effect.  To  address  how  Arg  regulates  the  complex,  I  will  learn  how  to  conduct  functional  TIRFM single-­ filament based assays to define the minimal domain of Arg that is sufficient to activate the Arp2/3  complex. My preliminary data indicate that Arg can directly bind the Arp2/3 complex. I will expand these binding  assays and learn how to conduct chemical crosslinking experiments to determine (1) the minimal Arg fragment  that can make a high affinity interaction with the Arp2/3 complex and (2) the subdomain contacts through which  Arg interacts with the Arp2/3 complex, respectively. Finally, I will develop two methods to determine how cortactin  can  coordinate  with  Arg  to  stimulate  Arp2/3  activation.  Two-­color  single  molecule  TIRF  assays  will  address  if  cortactin  recruits  Arg  to  branch  points  and  competition  binding  assays  will  determine  if  cortactin  functions  (mechanistically) to release Arg from nascent branch points, allowing filament elongation.  Aim  2.  To  determine  the  mechanisms  through  which  Arg  and  cortactin  regulate  spine  stability.  Arg,  cortactin  and  the  Arp2/3  complex  are  concentrated  in  dendritic  spines  and  each  is  required  for  spine  stability,  but how they interact to confer this stability is not understood. Preliminary data collected in the lab suggests that  loss of cortactin initially reduces stable F-­actin prior to dendritic spine destabilization. Using well-­defined Arg or  cortactin mutants, I will perform knockdown/complementation and confocal microscopy in cultured hippocampal  neurons to determine how disruptions of Arp2/3 complex regulation affect spine dynamic behavior and stability.  I will use GFP-­actin fluorescent recovery after photobleaching (FRAP), employing the approaches used by my  collaborator, with the same mutant cohort to determine how these proteins impact spine stability via control of  the stable and dynamic actin pools.