The yeast surface as a platform for inhibitor discovery

筛选技术的进步已经使针对生物靶标的配体发现成为常规，但 将结合配体转化为特异性酶抑制剂是极具挑战性的，即使对于金属蛋白酶也是如此 和其他具有明确活性位点的酶。由于缺乏特异性抑制剂， 细胞外基质重塑等基本生物过程。蛋白质和小分子都缺乏关键的 抑制剂的特性。抗体和其他蛋白质很少破坏酶的功能，但通常表现出较高的活性。 结合特异性小分子通常缺乏单核苷酸酶特异性，但会干扰酶促反应。 活动这两种方式都不太适合产生有效的特异性酶抑制剂。 我的长期目标是：1）建立发现有效的、特异性抑制剂的一般原则， 医学相关的酶; 2）利用产生的抑制剂来了解酶的作用， 金属蛋白酶在正常生理和病理过程中的作用。我假设同时 利用蛋白质和小分子的互补优势将产生全新的类别 有效的特异性抑制剂在此建议期间的目标是转换酵母显示，一个强大的 配体发现平台，转化为全面的抑制剂发现平台。我的实验室已经建立了 用于扩展可与酵母展示组合使用的化学功能的策略。在这里， 我们将进一步增强我们的平台，并利用它来识别针对金属蛋白酶测试集的抑制剂， 目标的在这个过程中，我们将获得关于如何产生无法获得的抑制剂的基本见解 使用任何当前的抑制剂发现方法，为1）一个大大扩展的工具包， 基础生物学; 2）更广泛的抑制剂发现工作。我们将追求的初步方向是： 方向1.扩大了酵母展示蛋白质中可编码的化学物质的范围。 含有典型氨基酸的蛋白质缺乏酶抑制剂中发现的关键基团。我们将利用我们的 ncAA掺入的定量报告基因，以编码酵母展示蛋白中的这些功能。 方向2.建立定量评估酵母表面酶抑制的测定方法。 没有现有的显示技术支持在高浓度期间对酶抑制的定量评价。 通量筛选我们将利用双酵母展示技术来建立这些能力。 方向3.使用化学增强抗体库来进化有效的特异性抑制剂。 抗体很少抑制酶。我们将产生和筛选含有添加的抗体的文库， 化学组建立抑制剂的分离在这个未开发的发现空间的一般原则。 为了集中我们的发现努力，我们和我们的合作者已经从多种来源中鉴定了金属蛋白酶。 家庭在人类健康和疾病方面发挥着重要作用。我们建立的一般发现原则 这将直接导致了解和治疗人类疾病的新型抑制剂。

Advances in screening technologies have made ligand discovery against biological targets routine, but  converting binding ligands into specific enzyme inhibitors is extremely challenging, even for metalloproteinases  and other enzymes with well-­defined active sites. The lack of specific inhibitors prevents full elucidation of  biological processes as basic as extracellular matrix remodeling. Proteins and small molecules each lack key  features of inhibitors. Antibodies and other proteins rarely disrupt enzyme function, but usually exhibit high  binding specificity. Small molecules frequently lack single-­enzyme specificity, but interfere with enzymatic  activity. Neither of these modalities is well-­suited for generating potent, specific enzyme inhibitors.  My long-­term goals are to 1) establish general principles for discovering potent, specific inhibitors against  medically relevant enzymes;; and 2) utilize the resulting inhibitors to understand the roles of enzymes such as  metalloproteinases in normal physiology and pathological processes. I hypothesize that simultaneously  leveraging the complementary strengths of proteins and small molecules will give rise to entirely new classes  of potent, specific inhibitors. The goal during this proposal period is to convert yeast display, a powerful  ligand discovery platform, into a comprehensive inhibitor discovery platform. My lab has already established  strategies for expanding the chemical functionality that can be utilized in combination with yeast display. Here,  we will enhance our platform further and use it to identify inhibitors against a test set of metalloproteinase  targets. In the process, we will gain fundamental insights into how to generate inhibitors that are not accessible  using any current inhibitor discovery approaches, setting the stage for 1) a greatly expanded toolkit for studying  basic biology;; and 2) much broader inhibitor discovery efforts. The initial directions we will pursue are:  Direction 1. Expand the range of chemistries that can be encoded in yeast-­displayed proteins.  Proteins containing canonical amino acids lack key groups found in enzyme inhibitors. We will utilize our  quantitative reporter of ncAA incorporation to encode these functionalities in yeast-­displayed proteins.  Direction 2. Establish assays for quantitatively evaluating enzyme inhibition on the yeast surface.  No existing display technologies support quantitative evaluations of enzyme inhibition during high  throughput screening. We will utilize dual yeast display technology to establish these capabilities.  Direction 3. Use chemically augmented antibody libraries to evolve potent, specific inhibitors.  Antibodies rarely inhibit enzymes. We will generate and screen libraries of antibodies containing added  chemical groups to establish general principles for inhibitor isolation in this unexplored discovery space.  To focus our discovery efforts, we and our collaborators have identified metalloproteinases from multiple  families that play important roles in human health and disease. The general discovery principles we establish  here will lead directly to new classes of inhibitors for understanding and treating human disease.