Using Bacterial Effectors to Uncover Innate Immune Mechanisms Restricting Viral Replication in Bat Cells

项目摘要 蝙蝠是影响人类的各种病毒病原体的重要宿主。然而，我们有一个贫穷的 了解限制病毒复制的蝙蝠先天免疫关键因素。 功能测定， 要了解先天性免疫，需要确定与对抗病毒真正相关的蝙蝠因素， 最终确定蝙蝠对病毒感染的易感性的机制。虽然历史上这样的功能屏幕 依赖于全基因组的基因组编辑（例如CRISPR-RNAi Cas9）-siRNA或基于RNAi的RNA干扰（RNAi） 尽管使用了先进的技术，但大多数蝙蝠物种都无法使用这种平台。因此，新的方法来揭示功能性的， 需要蝙蝠对病毒感染的免疫应答的相关组分。为了满足这一需求，我们 开发了一种创新的虫媒病毒“拯救”测定法，其中免疫逃逸蛋白（IEPs）由 哺乳动物病原体可以在蝙蝠细胞中表达 虫媒病毒感染候选IEP表达后虫媒病毒复制的增强表明 IEP可能会抑制蝙蝠的免疫机制，通常限制虫媒病毒的复制。 使用这些IEP作为 “工具”，然后可以确定这些IEPs针对的蝙蝠免疫因素。 因此，这种筛选方法 提供了一种机制，以确定新的IEPs和蝙蝠免疫功能相关的成分， 反应为了发现促进虫媒病毒在蝙蝠细胞中复制的IEPs，我们将筛选表达文库， 编码约200种细菌效应蛋白。细菌效应子是由病原菌分泌到细胞中的蛋白质。 调节或抑制各种真核细胞过程以促进细菌生长的真核宿主细胞 复制的 许多在真核宿主细胞的细胞质中复制的细菌病原体编码效应子 作为IEP的功能。因此，我们假设一些效应物可能抑制免疫反应， 细菌和细胞质病毒如虫媒病毒。 事实上，我们的初步筛选已经确定了四个 当在蝙蝠细胞中表达时，促进四种不同虫媒病毒复制的效应物。 我们有 将这些效应筛选“命中”之一表征为靶向未表征的环的新型泛素连接酶， 指状（RNF）结构域-包含在真核细胞中降解的蛋白质。重要的是，这种RNAi消耗 人和蝙蝠细胞中的RNF因子促进虫媒病毒复制，这表明它可能是一种新的成分 人类和蝙蝠的免疫反应。这些结果表明，我们可以使用细菌效应器作为工具， 抑制和鉴定蝙蝠中功能性免疫相关的免疫因子。本研究的具体目标如下：1） 鉴定在蝙蝠细胞中促进虫媒病毒复制的细菌效应蛋白; 与来自我们的虫媒病毒拯救测定的效应子“命中”相互作用; 3）确定哪些蝙蝠宿主因子 与效应蛋白的相互作用影响病毒复制。 我们的长期目标是利用这个模型系统， 定义限制虫媒病毒复制的关键蝙蝠先天免疫机制。

Project Summary    Bats are important reservoirs for diverse viral pathogens affecting humans. However, we have a poor  understanding  of the  key bat  innate  immunity factors  that  restrict  virus  replication.  Functional  assays  that  can  identify  bat  factors  that  are  truly  relevant  to  combating  viruses  are  needed  to  understand  the  innate  immune  mechanisms that ultimately define bat susceptibility to viral infection. While historically such functional screens  have  relied  on  genome-­wide  genomic  editing  (e.g.  CRISPR-­Cas9)-­  or  RNA  interference  (RNAi)-­based  techniques, such platforms are unavailable for most bat species. Thus, new methods for uncovering functionally-­ relevant components of the bat immune response to virus infection are needed. To address this need, we have  developed  an  innovative  arbovirus  "rescue"  assay  wherein  immune  evasion  proteins  (IEPs)  encoded  by  mammalian pathogens can be expressed in bat cells and one can assay for changes in bat cell susceptibility to  arbovirus infection. Enhancement of arbovirus replication after expression of a candidate IEP indicates that the  IEP  likely  inhibits  bat  immunity  mechanisms  that  normally  restrict  arbovirus  replication.  Using  these  IEPs  as  "tools",  one  can  then  identify  the  bat  immunity  factors  these  IEPs  target.  Thus,  this  screening  methodology  provides  a  mechanism  to  both  identify  novel  IEPs  and  functionally-­relevant  components  of  the  bat  immune  response. To discover IEPs that promote arbovirus replication in bat cells, we will screen an expression library  encoding ~200 bacterial effector proteins. Bacterial effectors are proteins secreted by pathogenic bacteria into  eukaryotic  hosts  cells  that  modulate  or  inhibit  various  eukaryotic  cellular  processes  to  promote  bacterial  replication.  Many  bacterial  pathogens  that  replicate  in the  cytoplasm  of  eukaryotic  host cells  encode  effectors  that function as IEPs. Thus, we hypothesize that some effectors may suppress immune responses that restrict  both  bacteria  and  cytoplasmic  viruses  such  as  arboviruses.  Indeed,  our  initial  screens  have  identified  four  effectors  that  promote  the  replication  of  four  different  arboviruses  when  expressed  in  bat  cells.  We  have  characterized one of these effector screen "hits" as a novel ubiquitin ligase that targets an uncharacterized Ring  Finger (RNF) Domain-­containing protein for degradation in eukaryotic cells. Importantly, RNAi depletion of this  RNF factor in human and bat cells promotes arbovirus replication, suggesting that it may be a novel component  of human and bat immune responses. These results suggest that we can use bacterial effectors as tools to both  inhibit, and identify, functionally-­relevant immunity factors in bats. Our study has the following specific aims: 1)  Identify  bacterial  effector  proteins  that  promote  arbovirus  replication  in  bat  cells;;  2)  Identify  bat  proteins  interacting  with  effector  “hits”  from  our  arbovirus  rescue  assays;;  and  3)  Determine  which  bat  host  factors  interacting  with  effector  protein  hits  affect  viral  replication.  Our  long-­term  goal  is  to  use  this  model  system  to  define the key bat innate immune mechanisms that restrict arbovirus replication.