抑制素基因对山羊卵泡发育的调控作用及作用机制研究

采用基因多态性分析、RNAi、超表达、DNA甲基化分析等方法，从体内、外两个水平和基因多态性、表达水平和表达调控三个层面，研究了抑制素基因对卵泡发育的调控作用及作用机制。①筛选了抑制素基因12个多态位点的多态性，分析了其与山羊产羔数、超数排卵性状的关系，共计发现了5个多态性位点与山羊产羔数性状有显著相关，但抑制素各基因型个体超数排卵性状差异不显著；分析了与抑制素基因连锁的8个微卫星位点的多态性，共发现了与山羊产羔数性状相关的微卫星位点基因座11个；分析了抑制素作用的靶基因FSH基因的多态性及其对超数排卵性状的影响，结果显示FSH不同基因型个体超数排卵性状差异显著，说明抑制素可在体内调控山羊卵泡发育和产羔数性状，还可通过负反馈机制调控其靶基因FSH，从而调控山羊超数排卵性状；此外，还分析了MSTN基因对山羊生长性状的影响，发现了影响山羊生长性状的分子标记；这为筛选同时具备高繁殖率性状和高生长性状的标记辅助选择技术提供了技术支撑；②抑制素基因在腔前卵泡、小卵泡、中卵泡、大卵泡和排卵前卵泡中转录和表达水平存在差异，抑制素基因RNAi和超表达研究结果显示，抑制素基因可通过调控Bcl-2家族基因表达水平，影响卵泡颗粒细胞的凋亡与增殖，同时还影响颗粒细胞周期和类固醇激素（雌二醇和孕酮）分泌水平；说明抑制素基因对体外卵泡发育具有重要的局部调控作用；③以上实验说明了抑制素可以在体内和体外水平上影响卵泡发育，为了进一步说明抑制素的表达调控模式，我们筛选了抑制素基因的核心启动子，研究了抑制素基因启动子区不同位点甲基化水平对抑制素基因启动子活性的影响，阐明了抑制素基因的表观遗传调控模式，说明启动子区DNA甲基化是调控抑制素基因表达和活性的主要方式之一；④为了提高实验中的卵母细胞利用率，我们进行了山羊卵母细胞冷冻保存技术研究，实验结果显示，海藻糖可替代传统的蔗糖做为抗冻保护剂；⑤为了筛选抑制素基因上游可能的调控因子，我们采用illumina测序平台的单端测序模式对山羊卵巢中的小片段RNA样本进行高通量测序，共计发现12个山羊novel miRNA，其中4个位于X染色体上，这为我们今后进一步研究卵泡发育的miRNA调控模式奠定了良好的基础。这些理论成果可为建立繁殖性状标记辅助选择方法和超数排卵、体外卵泡发育预测方法，开发提高卵母细胞利用率的新技术奠定基础，促进胚胎工程和基因育种新技术的发展。