High-resolution sequence-function mapping of full-length proteins.
High-resolution sequence-function mapping of full-length proteins.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0118193
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发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Whitehead TA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kowalsky CA;Klesmith JR;Stapleton JA;Kelly V;Reichkitzer N;Whitehead TA
全面的序列功能映射涉及通过比较选择感兴趣表型之前和之后每个文库变体的丰度来详细说明每个可能的单个突变对基因的适应性贡献。 DNA 文库的深度测序允许在一次实验中重建数万个变体的频率，但当前测序仪的读长较短，使得探测编码全长蛋白质的基因具有挑战性。在这里，我们通过模块化、通用的序列平铺方法将序列功能图谱的范围扩展到整个蛋白质序列。我们展示了基于生长的选择和 FACS 筛选的方法，提供了简化实验设计的参数和最佳实践，并提出了分析解决方案以标准化独立选择中的数据。使用该协议，可以在四到六周内获得覆盖完整序列的序列功能图。本手稿中介绍的最佳实践与其他最近发布的序列功能映射协议完全兼容并互补。
Comprehensive sequence-function mapping involves detailing the fitness contribution of every possible single mutation to a gene by comparing the abundance of each library variant before and after selection for the phenotype of interest. Deep sequencing of library DNA allows frequency reconstruction for tens of thousands of variants in a single experiment, yet short read lengths of current sequencers makes it challenging to probe genes encoding full-length proteins. Here we extend the scope of sequence-function maps to entire protein sequences with a modular, universal sequence tiling method. We demonstrate the approach with both growth-based selections and FACS screening, offer parameters and best practices that simplify design of experiments, and present analytical solutions to normalize data across independent selections. Using this protocol, sequence-function maps covering full sequences can be obtained in four to six weeks. Best practices introduced in this manuscript are fully compatible with, and complementary to, other recently published sequence-function mapping protocols.
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